Hier stellen wir eine MATLAB-Implementierung des automatisierten Nachweises und der quantitativen Beschreibung von Lipidtröpfchen in Fluoreszenzmikroskopiebildern von Spalt- und angehenden Hefezellen vor.
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Methodenartikel
Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Fettstoffwechsel und seine Regulierung sind sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandten Biowissenschaften und die Biotechnologie von Interesse. In dieser Hinsicht werden verschiedene Hefearten als Modelle in der Fettstoffwechselforschung oder für die industrielle Lipidproduktion verwendet. Lipidtröpfchen sind hochdynamische Speicherkörper und ihr zellulärer Inhalt stellt eine bequeme Auslesung des Fettstoffwechselzustands dar. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode der Wahl für die quantitative Analyse zellulärer Lipidtröpfchen, da sie auf weit verbreitete Geräte angewiesen ist und die Analyse einzelner Lipidtröpfchen ermöglicht. Darüber hinaus kann die mikroskopische Bildanalyse automatisiert werden, was den Gesamtanalysedurchsatz erheblich erhöht. Hier beschreiben wir einen experimentellen und analytischen Workflow zur automatisierten Detektion und quantitativen Beschreibung einzelner Lipidtröpfchen in drei verschiedenen Modellhefearten: den Spalthefen Schizosaccharomyces pombe und Schizosaccharomyces japonicus, und die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae. Lipidtröpfchen werden mit BODIPY 493/503 visualisiert, und zellunpermeablefluoreszierende Dextran wird den Kulturmedien hinzugefügt, um Zellgrenzen zu identifizieren. Zellen werden in grünen und blauen Kanälen der 3D-Epifluoreszenzmikroskopie unterzogen und die resultierenden Z-Stack-Bilder werden automatisch von einer MATLAB-Pipeline verarbeitet. Das Verfahren gibt umfangreiche quantitative Daten über den zellulären Lipidtröpfchengehalt und die individuellen Lipidtröpfcheneigenschaften in einem tabellarischen Format aus, das für nachgelagerte Analysen in großen Tabellen- oder statistischen Paketen geeignet ist. Wir bieten Beispielanalysen des Fetttröpfchengehalts unter verschiedenen Bedingungen, die den zellulären Fettstoffwechsel beeinflussen.
Einleitung
Lipide spielen eine entscheidende Rolle im Zellenergie- und Kohlenstoffstoffwechsel, bei der Synthese von Membrankomponenten und bei der Produktion bioaktiver Substanzen. Der Fettstoffwechsel wird entsprechend den Umweltbedingungen, der Nährstoffverfügbarkeit und der Zellzyklusphase1abgestimmt. Beim Menschen ist der Fettstoffwechsel mit Krankheiten wie Fettleibigkeit, Typ-II-Diabetes und Krebs verbunden2. In der Industrie stellen Lipide, die von Mikroorganismen wie Hefen hergestellt werden, eine vielversprechende Quelle für erneuerbare Dieselkraftstoffedar 3. Zellen speichern neutrale Lipide in so....
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Protokoll
1. Vorbereitung von Lösungen und Medien
-
Bereiten Sie Lipid-Färbunglösung.
- Zur Herstellung von Lagerlipid-Färbunglösung lösen 10 mg BODIPY 493/503 in 10 ml wasserfreien DMSO (Endkonzentration 1 mg/ml). Lösen Sie den gesamten Gehalt einer 10 mg BODIPY 493/503 Durchstechflasche auf, um Materialverluste beim Wiegen zu verhindern.
ACHTUNG: DMSO kann durch die Haut passieren. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung. - Bereiten Sie die arbeitsfähige Lipid-Färbungslösung vor, indem Sie 100 l der 1 mg/ml BODIPY 493/503-Stammlösung und 900 l wasserfreien DMSO (Endkonzentration 0,1 mg/ml) mischen.<....
- Zur Herstellung von Lagerlipid-Färbunglösung lösen 10 mg BODIPY 493/503 in 10 ml wasserfreien DMSO (Endkonzentration 1 mg/ml). Lösen Sie den gesamten Gehalt einer 10 mg BODIPY 493/503 Durchstechflasche auf, um Materialverluste beim Wiegen zu verhindern.
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Ergebnisse
Das gesamte Verfahren ist in Abbildung 1 für die Spalthefen zusammengefasst (der angehende Hefe-Workflow ist analog), und unten finden Sie Beispiele dafür, wie der Workflow verwendet werden kann, um LD-Inhalte in drei verschiedenen Hefearten unter verschiedenen bekannten Bedingungen zu untersuchen. um den Zell-LD-Inhalt zu beeinflussen. Jedes Beispiel stellt ein einziges biologisches Experiment dar.
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Diskussion
Das Verständnis des Fettstoffwechsels und seiner Regulierung ist sowohl für die Grundbiologie als auch für klinische und biotechnologische Anwendungen wichtig. Der LD-Gehalt stellt eine bequeme Auslesung des Lipidstoffwechselzustands der Zelle dar, wobei die Fluoreszenzmikroskopie eine der wichtigsten Methoden zur Bestimmung des LD-Gehalts ist. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Detektion und quantitative Beschreibung einzelner LDs in drei verschiedenen und morphologisch unterschiedlichen Hefearten........
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der Karlsuniversität PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 und SVV 260310 unterstützt. Wir danken Ond'ej ebesta für die Hilfe bei der Mikroskopie und der Entwicklung der Bildanalyse-Pipeline. Wir danken dem ReGenEx-Labor für S. cerevisiae-Stämme und JapoNet und Hironori Nikis Labor für S. japonicus-Stämme. Der ppc1-88 Stamm wurde vom Yeast Genetic Resource Center Japan bereitgestellt. Die Mikroskopie wurde im Labor für Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, das vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und dem Staatshaushalt der Tschechischen Republik kofinanziert wurde (Projekt Nr. CZ.1.05/4.....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12-Bit-monochrome CCD-Kamera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | oder gleichwertig | |
| Adenin-Hemisulfat-Salz, ≥ 99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluor-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | für die neutrale Lipidfärbung |
| D-(+) - Glukose, ≥ 99,5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, anionisch, Lysin fixierbar | Thermo Fisher Scientific | D1976 | für die Negativfärbung von Zellen |
| Dimethylsulfoxid, ≥ 99,5 % | Merck | D4540 | oder höhere Reinheit, auf Molekularsieben wasserfrei halten |
| EMM-Brühe ohne Dextrose | Formedium | PMD0405 | Medium kann auch aus einzelnen Komponenten hergestellt werden |
| Fiji/ImageJ Software | NIH& | nbsp; | oder gleichwertig; für die visuelle Inspektion mikroskopischer Daten |
| Hochpräzises Deckglas, 22 mm x 22 mm, Nr. 1.5 | VWR | 630-2186 | beliebig # 1.5 Deckglas Image |
| Processing Toolbox für MATLAB, Version 10.0 | Mathworks | ||
| Lektin aus Glycin max (Sojabohne) | Merck | L1395 | zur Zellimmobilisierung auf Objektträgern |
| MATLAB Software, Version 9.2 | Mathworks | ||
| Objektträger, 26 mm x 76 mm, 1 mm Dicke | Knittel Glass | L762601.2 | Verwenden Sie einen Objektträger, der zu Ihrem Mikroskoptisch passt, und reinigen Sie ihn gründlich, bevor Sie die Zellen belasten |
| Olympus CellR Mikroskop mit automatischer z-Achsen-Objektivbewegung | Olympus | oder gleichwertig | |
| Pentaband Filterset | Semrock | F66-985 | Hellfeld, grüne und blaue Kanäle sind ausreichend |
| Signal Processing Toolbox für MATLAB, Version 7.4 | Mathworks | ||
| SP Nahrungsergänzungsmittel | Formedium | PSU0101 | |
| Standard-Bürocomputer, auf dem MATLAB ausgeführt werden kann | |||
| Statistik und maschinelles Lernen Toolbox für MATLAB, Version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal-Pepton M66 für die Mikrobiologie | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO Objektiv | Olympus | oder gleichwertig | |
| Hefeextrakt | Formedium YEA03 | ||
| Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren | Formedium | CYN0405 |
Referenzen
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
