تحليل الغلوبولين المناعي G-Glycan بواسطة اللوني السائل فائق الأداء
Summary
ويتميز الغلوبولين المناعي G (مفتش) N-glycan باستخدام التفاعل هيدروفيلييك اللوني uplc. الاضافه إلى ذلك ، يتم فصل هيكل مفتش N-glycan بشكل واضح. يقدم هنا مقدمه لهذه الطريقة التجريبية بحيث يمكن استخدامها علي نطاق واسع في إعدادات البحث.
Abstract
غليكوميكس هو تخصص فرعي جديد في البحوث نظام اوميكس التي توفر إمكانات كبيره في اكتشاف الجيل التالي من المؤشرات الحيوية للاصابه بالمرض ، واكتشاف هدف المخدرات ، والطب الدقيق. وقد تم الإبلاغ عن البديلة مفتش ن-غليكانز في العديد من الامراض المزمنة الشائعة ، واقترح ان يكون لها إمكانات كبيره في التطبيقات السريرية (اي ، المؤشرات الحيوية للتشخيص والتنبؤ بالامراض). وتتميز علي نطاق واسع مفتش ن-غليكانز باستخدام طريقه التفاعل هيدروفيلي اللوني (hilic) اللوني السائل فائقه الأداء (uplc). UPLC هو تكنولوجيا الكشف مستقره مع استنساخ جيده وعاليه الدقة الكمية النسبية. الاضافه إلى ذلك ، يتم فصل هيكل مفتش ن-glycan بشكل واضح ، وتتميز تكوين glycan ووفره نسبيه في البلازما.
Introduction
N-glycosylation من البروتينات البشرية هو تعديل المشتركة والاساسيه بعد الانتقالية1 وقد تساعد علي التنبؤ بحدوث وتطور الامراض بشكل دقيق نسبيا. نظرا لتعقيد هيكلها ، فمن المتوقع ان هناك أكثر من 5,000 glycan الهياكل ، وتوفير إمكانات كبيره كما التشخيص والمؤشرات الحيوية التنبؤيه للامراض2. N-غليكانز تعلق علي الغلوبولين المناعي G (مفتش) وقد ثبت ان تكون ضرورية لوظيفة مفتش ، ومفتش ن-glycosylation يشارك في التوازن بين الموالية للانظمه والمضادة للالتهابات3. وتشارك التفاضلية مفتش ن-glycosylation في تطوير الامراض والتقدم ، والتي تمثل كل من الاستعداد واليه الوظيفية المشاركة في امراض المرض. وقد ارتبط الدور التهابي من مفتش ن-glycosylation مع الشيخوخة, الامراض التهابيه, امراض المناعة الذاتية, والسرطان4.
مع تطوير تكنولوجيا الكشف ، وتستخدم الطرق التالية علي نطاق واسع في غليكوميكس عاليه الانتاجيه: اللوني تفاعل هيدروفيلي (HILIC) اللوني السائل فائقه الأداء مع الكشف عن الفلورية (UPLC-FLR) ، متعدد الشعرية هلام الكهربائي مع الليزر التي يسببها الكشف عن الفلورية (Xgggg-ليف) ، مصفوفة بمساعده الليزر/تاين الوقت من الطيران الطيف الكتلي (MALDI-تسوف-MS) ، واللوني السائل الحراري الطيف الكتلي (LC-ESI-MS) . وقد تغلبت هذه الأساليب علي أوجه القصور السابقة للتدفق المنخفض ، والنتائج غير المستقرة ، وخصوصية الحساسية الضعيفة5،6.
ويستخدم علي نطاق واسع UPLC لاستكشاف العلاقة بين مفتش ن-glycosylation وبعض الامراض (اي ، الشيخوخة7، السمنة8، ديسسليبيدميا9، النوع الثاني السكري10، ارتفاع ضغط الدم11، السكتة الدماغية12، ومرض باركنسون13). بالمقارنة مع الطرق الثلاثة المذكورة أعلاه ، uplc لديه المزايا التالية5،14. أولا ، فانه يوفر طريقه التحليل الكمي النسبي ، وتحليل البيانات التي تنطوي علي تطبيع المنطقة الاجماليه يحسن قابليه للمقارنة لكل عينه. ثانيا ، تكلفه المعدات والخبرات المطلوبة منخفضه نسبيا ، مما يجعل من الأسهل لتنفيذ وتحويل العلامات الحيوية الغليكويليشن في التطبيقات السريرية. يقدم هنا مقدمه إلى UPLC بحيث يمكن استخدامها علي نطاق أوسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uplc بمثابه التحليل الكمي النسبي طريقه5،15. وتشير النتائج إلى ان UPLC هو تكنولوجيا الكشف مستقره مع استنساخ جيده والدقة الكمية النسبية. يتم التعبير عن كميه غليكانز في كل ذروه كنسبه مئوية من إجمالي المنطقة المتكاملة باستخدام UPLC ، وهي القيمة النسبية. ويؤدي القياس ا…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمه من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81673247 & 81872682) والمنحة التعاونية الاستراليه الصينية (NH & APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Referenzen
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
