Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkung von Streptococcus pneumoniae mit der Oberfläche von Endothelzellen wird im Blutfluss über mechanosensitive Proteine wie den Von Willebrand Factor (VWF) vermittelt. Dieses Glykoprotein verändert seine molekulare Konformation als Reaktion auf Scherspannung und setzt so Bindungsstellen für ein breites Spektrum von Wirts-Ligand-Wechselwirkungen frei. Im Allgemeinen ist die Kultivierung von primären Endothelzellen unter einem definierten Scherfluss dafür bekannt, die spezifische zelluläre Differenzierung und die Bildung einer stabilen und eng verbundenen Endothelschicht zu fördern, die der Physiologie der inneren Auskleidung eines Blutgefäßes ähnelt. . Daher erfordert die funktionelle Analyse von Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und der Wirtsvaskulatur mit mechanosensitiven Proteinen die Etablierung von Pumpensystemen, die die physiologischen Strömungskräfte simulieren können, von denen bekannt ist, dass sie die Oberfläche Gefäßzellen.

Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät ermöglicht eine kontinuierliche und pulslose Rückführung von Flüssigkeiten mit einer definierten Durchflussrate. Das computergesteuerte Luftdruckpumpensystem wendet eine definierte Scherspannung auf endotheliale Zelloberflächen an, indem es einen kontinuierlichen, unidirektionalen und kontrollierten mittleren Durchfluss erzeugt. Morphologische Veränderungen der Zellen und bakterielle Anhaftung können im Fluss mikroskopisch überwacht und quantifiziert werden, indem spezielle Kanalschlitten verwendet werden, die für die mikroskopische Visualisierung entwickelt wurden. Im Gegensatz zur statischen Zellkulturinfektion, die im Allgemeinen eine Probenfixierung vor der Immunkennzeichnung und mikroskopischen Analysen erfordert, ermöglichen die mikrofluidischen Dias sowohl den fluoreszenzbasierten Nachweis von Proteinen, Bakterien und zellulären Komponenten. nach der Probenfixierung; serielle Immunfluoreszenzfärbung; und direkte fluoreszenzbasierte Detektion in Echtzeit. In Kombination mit fluoreszierenden Bakterien und spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern bietet dieses Infektionsverfahren ein effizientes Mehrkomponenten-Visualisierungssystem für ein riesiges Spektrum wissenschaftlicher Anwendungen im Zusammenhang mit gefäßbedingten Prozessen.

Einleitung

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort de....

Protokoll

Die mikrofluidische Zellkultivierung wurde mit kommerziellen primären menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Das Unternehmen isolierte die Zellen mit informierter Zustimmung des Spenders. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer des Landes Baden-Württemberg mit der Referenznummer 219-04 genehmigt.

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Protokolllieferungen.

1. Präkultivierung der primären Endothelzellen

1. Eine gefrorene Glyzerin-Durchstechflasche mit 1 x 10⁵ primärer HUVEC von drei verschiedenen Spendern vorsichtig ....

Ergebnisse

Die Kultivierung von primärer HUVEC in einem konstanten unidirektionalen Fluss führt zur Bildung einer konfluenten und dicht gepackten Zellschicht, die die Erzeugung von zellulären WPBs fördert, die mit dem mechanosensitiven VWF^13,14gefüllt sind. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines luftdruckpumpenbasierten, pulslosen Rezirkulationssystems für die Infektionsanalyse, das die Scherstresssituation im menschlichen Blutfluss nachahmt.

Diskussion

Die Simulation der bakteriellen Interaktion mit mechanosensitiven Wirtsproteinen wie VWF erfordert ein durchwegsnutzbares Zellkultursystem, das die Erzeugung eines definierten, unidirektionalen und kontinuierlichen Flüssigkeitsflusses ermöglicht und so eine zuverlässige Scherspannung erzeugt. . Mehrere mikrofluidische Pumpensysteme wurden bereits beschrieben. Ein ausführlicher Überblick von Bergmann et al. fasst die Wesentlichen Aspekte verschiedener zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodelle^{zusammen.......}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Luer-Spritze	Fisher Scientific	10303002	mit 1 mL Volumen für die Gelatine-Injektion unter Verwendung des Luer-Anschlusses der Objektträger
2 mL Luer-Spritze	Sarstedt	9077136	Zum Pippieren/Injizieren von Flüssigkeiten in die Luer-Anschlüsse der Kanalkammer-Objektträger
Accutase	eBioscience jetzt Thermo Fisher	00-4555-56	Proteasemischung zur schonenden Ablösung von Endothelzellen
AlexaFluor350-konjugiertes Phalloidin	Abcam	ab176751	keine Konzentration vom Hersteller verfügbar, Stammlösung reicht für 300 Tets, Unternehmen empfiehlt die Verwendung von 100 & Mikro; L einer Verdünnung im Verhältnis 1:1.000, blaue Fluoreszenz (DAPI-Filtereinstellungen)
AlexaFluor488-konjugierter Anti-Maus-Antikörper aus Ziege	Thermo Fisher Sientific	A11001	Stammkonzentration: 2 mg/ml für die Immunfärbung von humanem VWF in mikrofluidischen Objektträgern nach PFA-Fixierung, grüne Fluoreszenz
AlexaFluor568-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziege	Thermo Fisher Scientific	A-11011	Stammkonzentration: 2 mg/mL zur Immunfärbung von Pneumokokken in mikrofluidischen Objektträgern nach pFA-Fixierung, rote Fluoreszenz
Bacto Todd-Hewitt-Bouillon	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	komplexes Bakterienkulturmedium
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilisiert, zur Herstellung von Blockierungspuffer
Zellkulturkolben mit Filter	TPP	90026	Subkultivierung von HUVEC in unbeschichteten Zellkulturkolben mit einer Oberfläche von 25 cm2
Zentrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	Schleudern von Bakterien (Volumina von >2 mL)
Zentrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	Schleudern von eukaryotischen
Zellen Zentrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	Schleudern von Bakterien (Volumina von weniger als 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	verwendet in einer Konzentration von 0,2 mg/mL zur Kultivierung von Pneumokokken, transformiert mit genetischem Konstrukt mit rotfluoreszierendem Protein und Chloramphenicol-Resistenzkassette
Klemme für Perfusionsschlauch	ibidi	10821	zum Halten der Flüssigkeit im Röhrchen vor dem Verbinden des Objektträgers mit dem Pumpensystem
CO2-Inkubator	Fisher Scientific	MIDI 40	Inkubators ist perfekt an die Größe der Fluidikeinheit mit angeschlossenem Kanalschieber angepasst und wurde für die Strömungskultivierung bei 37 Grad verwendet; C und 5% CO2
CO2-Inkubator	Sanyo	MCO-18 AIC	für die Inkubation von Bakterien und Zellen in einer definierten Atmosphäre bei 5% CO2 und 37 &/deg; C
Kolumbien Blut-Agar-Platten	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	Agar-basiertes komplexes Kulturmedium für S. pneumoniae ergänzt mit 7% Schafsblut
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter mit Druckpumpensoftware
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)	Leica	DMi8	Ein inverses Mikroskop mit einem Tisch, der von einer beheizbaren Kammer bedeckt ist, und mit einer Fluoreszenzeinheit, die mit Fluoreszenzfilter, Xenon-Lichtquelle (SP8, DMi8) und DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 Megapixel)
Di-Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	zur Verwendung für PBS-Puffer
Trocknungsmaterial	Merck	101969	orangefarbene Kieselsäurekügelchen zum Trocknen in einer Glasflasche mit einem Schlauchadapter
ECGM-Ergänzungsmischung Mix	Promocell	C-39215	Ergänzungsmischung für EKGM-Medium, erforderlich für die Präkultivierung von Endothelzellen: 0,02 ml/ml fötales Kälberserum, 0,004 ml/ml Ergänzung des Endothelzellwachstums, 0,1 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 1 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 90 & Mikro; g/mL Heparin, 1 & Mikro; g/mL Hydrocortison
ECGMS	Promocell	C-22010	EKGM ergänzt mit 5 % [w/w] FCS und 1 mM MgSO4 zur Erhöhung der Zelladhäsion
Endothelzell-Wachstumsmedium (EKGM, gebrauchsfertig)	Promocell	C-22010	Kulturmedium von HUVECs, bereits ergänzt mit allen Bestandteilen des Supplement-Mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrom jetzt	Merck S 0415	Zusatz für Zellkulturen, die für Infektionsanalysen verwendet
werden FITC-konjugierter Ziegen-Anti-Human-VWF-Antikörper	Abcam	ab8822	Stammkonzentration: 10 mg/ml, zur Immundetektion von globulären und multimerisierten VWF im Fluss
Fluidische Einheit	ibidi	10903	fluidische Einheit für die Durchflusskultivierung
Gelatine (Schweine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	zur Vorbeschichtung der Oberfläche des Mikroobjektträgerkanals
Histamindihydrochlorid	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	zur Induktion der VWF-Sekretion aus endothelialen Weibel Palade Körpern
Humane Nabelvenen-Endothelzelle (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primäre Endothelzellen von gepoolten Spendern, gelagert in flüssigem Stickstoff kristallkonserviert
Humaner VWF-spezifischer Antikörper aus Maus (monoklonal)	Santa Cruz	sc73268	Bestandskonzentration: 200 &Micro; g/mL zur Immunfärbung von VWF in mikrofluidischen Objektträgern nach PFA-Fixierung
Injektionsport		ibidi 10820	zur Injektion von Histamin oder Bakterien in den Reservoirschlauch während der Strömungszirkulation
Lichtmikroskop	Zeiss	Axiovert 35M	inverses Lichtmikroskop zur Kontrolle der eukaryotischen Zellablösung und Zellzählung mit einem 40-fachen Wasserobjektiv mit 400-facher Vergrößerung
Luer-Objektträger I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physikalisch modifizierte Objektträger für die Fludic-Kultivierung (μ – Objektträger I0,4Luer mit einer Kanalhöhe von 0,4 mm, einem Kanalvolumen von 100 μ L, einer Wachstumsfläche von 2,5 cm und einer Beschichtungsfläche von 25,4 cm2) geeignet für alle Arten von Flow-Assays, erzeugt die physikalische Behandlung eine hydrophile und haftende Oberfläche.
Magnesiumsulfat (MgSO4, unhydratisiert)	Sigma Aldrich	M7506-500G	Zur Vorbereitung von EKGMS Medium
Mikrofluidik Pumpe	ibidi	10905	Luftdruckpumpe
Neubauer Zellzählkammer	Karl Hecht GmbH & Co KG	40442002	mikroskopische Zählkammer für HUVECs
Paraformaldehyd 16% (PFA)	Elektronenmikroskopie Sciences	15710-S	zur Vernetzung von Proben
Perfusionsset	ibidi	10964	Perfusionsset Gelb/Grün hat einen Schlauchdurchmesser von 1,6 mm, eine Rohrlänge von 50 cm, ein Gesamtarbeitsvolumen von 13,6 mL, ein Totrohrvolumen von 2,8 mL und eine Reservoirgröße von 10 mL. kombiniert mit dem µ-slide L0.4Luer, bei 37 &°; C und einer Viskosität von 0,0072 dyn x s/cm2 kann ein Flussratenbereich von 3,8 mL/min bis 33,9 mL/min und eine Scherspannung zwischen 3,5 dyn/cm2 und 31,2 dyn/cm2 erreicht werden. mit einer Länge von 50 cm für mikrofluidische
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)			die Lösung wurde unter Verwendung der folgenden Chemikalien hergestellt: 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4
Kunststoffküvetten	Sarstedt	67,741	(2 x optisch) für OD-Messung bei 600 nm
Pneumokokken-spezifisches Antiserum	Pineda		gezüchtet beim Kaninchen mit hitzeinaktiviertem Streptococcus pneumoniae NCTC10319 und D39, IgG-gereinigt mit ProteinA-Sepharosesäule.
Polystyrol- oder Styroporplatte			Dies ist eine Vorsichtsmaßnahme, um Kältestress für die Zellen zu vermeiden, die in den Kanalobjektträgern ausgesät sind. Jede Art von Styropor, wie z.B. Verpackungskartonmaterial, kann verwendet werden. Die Platte könnte 0,5 cm dick sein und sollte eine Größe von 20 cm2 haben.
Kaliumchlorid (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	wird für PBS-Puffer verwendet
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computersoftware zur Steuerung der Druckpumpe, zum Einstellen der Strömungsbedingungen und zum Starten/Beenden der Strömung
Reaktionsröhrchen 1,5/2,0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	für Antikörperverdünnungen erforderlich
Reaktionsröhrchen mit 50 mL Volumen	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-exprimierende Pneumokokken	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae Serotyp 47 exprimierende RFP fusioniert mit ahistonähnlichem Protein, das in das Genom integriert
Serologische Pipetten 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	zum Pitieren größerer Volumina
Natriumcarbonat (Na2CO3, wasserfrei)	Sigma Aldrich	451614-25G	zur Herstellung von 100 mM Natriumcarbonatpuffer
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	zur Herstellung von PBS-Puffer
Spektralphotometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	Messung der optischen Dichte (OD) der bakteriellen Suspension bei 600 nm
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389-500G	zur Herstellung von Blockierungspuffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Wird in einer Endkonzentration von 0,1 % verdünnt in dH20 für die Permeabilisierung eukaryotischer Zellen nach PFA-Fixierung
verwendet Hefeextrakt		Oxoid LP0021	Bakterien werden im THB-Supplement mit 1% [w/w] Hefeextrakt = vollständiges bakterielles Kultivierungsmedium THY

Die Größe des , : ist kultiviert