השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.
עגבנייה היא יבול חשוב agronomically שיכול להיות נגוע על ידי פסאודומונס syringae, חיידק גראם שלילי, וכתוצאה מכך מחלת הגרגר חיידקי. העגבנייה-P. syringae pv. מערכת העגבניות היא בשימוש נרחב כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הצמח תגובות מולדים התנגדות המחלה. בעוד המחלה הצליחה בהצלחה במשך עשרות שנים רבות באמצעות המבוא של pto/Prf האשכול גנים מסולנום פיפינליות לתוך עגבניה מעובד, גזע 1 זנים של P. syringae התפתחו כדי להתגבר על התנגדות הענקת ידי pto/prf האשכול גנים ומתרחשים ברחבי העולם.
מינים עגבניות בר הם מאגרים חשובים של גיוון טבעי בזיהוי הפתוגן, כי הם התפתחו בסביבות מגוונות עם לחצים הפתוגן שונים. במסכים טיפוסיים עבור עמידות למחלות בעגבניות בר, צמחים למבוגרים משמשים, אשר יכול להגביל את מספר הצמחים שניתן לוקרן בשל זמן צמיחה המורחבת שלהם ודרישות שטח גדילה גדול יותר. פיתחנו שיטה למסך 10-יום-שתילי עגבניות של התנגדות, אשר ממזער את הצמיחה הצמח זמן וחלל קאמרית הצמיחה, מאפשר תחלופת מהירה של צמחים, ומאפשר לדגום גדלים גדולים להיבדק. שתילים התוצאות של הישרדות או מוות יכול להיות מטופלים כמו פנוטיפים דיסקרטית או על סולם ההתנגדות המוגדר על ידי כמות הצמיחה החדשה בשתילים ששרדו לאחר ההצפה. שיטה זו כבר ממוטבת למסך 10-יום-שתילי עגבניות התנגדות לשני זני p. syringae והוא יכול בקלות להתאים זנים p syringae אחרים.
פסאודומונס syringae הוא חיידק פתוגניים שלילי גרם מדביק מגוון רחב של מארחי הצמח. חיידקים להיכנס למפעל מארח דרך הסטוטה או פצעים פיזיים מתרבים בתוך האפוסט1. צמחים התפתחו תגובה חיסונית דו שכבתית כדי להגן מפני זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים. הרמה הראשונה מתרחשת במשטח התא של הצמח, שבו קולטני הזיהוי תבניות על קרום התא הצמח תופס מאוד שימור הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרי (PAMPs) בתהליך שנקרא PAMPS-מופעל חסינות (PAMPS)2. במהלך תהליך זה, המפעל המארח upregulates תגובת ההגנה מסלולים, כולל התצהיר של callose לקיר התא, סגירת שיניים, ייצור של מינים חמצן תגובתי, ו אינדוקציה של הגנים הקשורים בפתוגנזה.
חיידקים יכולים להתגבר על PTI על ידי ניצול סוג III הפרשה מערכת כדי לספק חלבונים, הנקראים מפלעריקים, ישירות לתא הצמח3. אפקטור חלבונים בדרך כלל המטרה מרכיבים של PTI ולקדם התקפה אלימה הפתוגן4. הרמה השנייה של חסינות הצמח מתרחשת בתוך תא הצמח על ידי הכרה של חלבונים האפקטור. הכרה זו תלויה גנים התנגדות, אשר לקודד נוקלאוטיד האתר מחייב לוקמיה עשיר לחזור המכיל קולטנים (NLRs). מסוגלים לזהות את העריקים ישירות או לזהות את פעילותם במטרה של התקפה אלימה או דמה5. לאחר מכן הם מפעילים תגובה חיסונית משנית בתהליך שנקרא אפקטור החיסון המופעל (אתי), אשר קשורה לעתים קרובות עם תגובה רגישות יתר (HR), צורה של מוות תאים מקומי באתר של זיהום6. לעומת התנגדות גנטית לגנים הקשורים אתי, הצמחים יכולים להפגין עמידות חלקית כמותית, אשר תלויה בתרומה של גנים מרובים7.
P. syringae pv. עגבניות (Pst) הוא סוכן סיבתי של גרגר חיידקי על עגבניות והוא בעיה חקלאית מתמשך. זנים השולט בשדה יש בדרך כלל מרוץ Pst 0 זנים המבטאים או שניהם מסוג III AvrPto ו AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) הוא גזע נציג 0 זן מודל פתוגן שיכול לגרום לגרגר חיידקי בעגבניה. כדי להילחם במחלת הגרגר החיידקי, המגדלים המאכבו את pto [P. syringae pv. עגבניה]/prf [pto התנגדות ו fenthion רגישות] שאשכול גנים מתוך מינים עגבניות פראי solanum פיפינאליןלזנים מודרניים8,9. הגן pto מקודד את החלבון סרין טראונין קינאז כי, יחד עם prf nlr, מעניקה עמידות ל PstDC3000 דרך ההכרה של העריקים AvrPto ו AvrPtoB10,11,12,13,14. עם זאת, התנגדות זו אינה יעילה נגד גזע המתעוררים 1 זנים, המאפשר התפשטות מהירה ואגרסיבית שלהם בשנים האחרונות15,16. גזע 1 זנים להתחמק הכרה על ידי האשכול pto/prf , כי AvrPto הוא איבד או מוטציה בזנים אלה, ו AvrPtoB מופיע לצבור מינימלית15,17,18.
אוכלוסיות עגבניות בר הם מאגרים חשובים של וריאציה טבעית עבור Pst התנגדות ובעבר שימשו כדי לזהות התנגדות פוטנציאל הרוח19,20,21. עם זאת, מסכי הנוכחי עבור עמידות הפתוגן לנצל 4 – 5-שבוע-צמחים למבוגרים בן20,21. לפיכך, הם מוגבלים בזמן הגדילה, בחלל חדר הצמיחה ובמידות קטנות יחסית. כדי להתמודד עם מגבלות של גישות קונבנציונליות, פיתחנו syringae בקצב גבוה של עגבניות P. שיטת התנגדות באמצעות שתילי עגבניות בן 10 ימים22. גישה זו מציעה מספר יתרונות על-ידי שימוש בצמחי מבוגרים: כלומר, זמן צמיחה קצר יותר, דרישות שטח מופחת ותפוקה גבוהה יותר. יתר על כן, הדגמנו כי גישה זו בנאמנות לכידה התנגדות המחלה פנוטיפים שנצפו בצמחים למבוגרים22.
בתיקון המבול שתיל המתואר בפרוטוקול זה, שתילי עגבניות גדלים על מנות פטרי של מדיה מורראשיג ו Skoog (MS) סטרילי במשך 10 ימים ולאחר מכן מוצפים באינת המכיל את החיידקים של הריבית ואת החומרים. בעקבות ההצפה, השתילים ניתן להעריך ככמת עבור התנגדות למחלות באמצעות assays הגידול חיידקי. בנוסף, שתיל הישרדות או מוות יכול לשמש התנגדות דיסקרטית או פנוטיפ המחלה 7 – 14 ימים לאחר ההצפה. גישה זו מציעה חלופה בתפוקה גבוהה עבור הקרנת מספר גדול של הגשת עגבניות בר עבור התנגדות pst מרוץ 1 זנים, כגון Pst להתאמץ t1 (pstt1), והוא יכול בקלות להיות מותאם לזנים חיידקיים אחרים של עניין.
פרוטוקול עבור המבול החיסון עם pstDC3000 או pstT1 אופטימיזציה כדי לזהות עמידות אלה זנים חיידקיים בשתילים עגבניות מתוארת. ישנם מספר פרמטרים קריטיים לקבלת תוצאות מיטביות של התנגדות שתיל, כולל ריכוז חיידקי וריכוז החומרים, אשר נקבעו באמצעות מדעית22. עבור PstDC3000, הצפיפות האו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לג Calma על בדיקת ההשפעה של עוצמת המדיה על המחלה או תוצאות ההתנגדות. אנו מודים לד ר מייסר באודין וד ר קרל שייבר ממעבדת לואיס למתן הערות והצעות בונות על כתב היד. מחקר על חסינות הצמח במעבדה לואיס היה נתמך על ידי משרד החקלאות בשנת 2030-21000-046-00D ו-2030-21000-050-00D (JDL), ואת מינהל NSF למדעי הביולוגיה IOS-1557661 (JDL).
3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
Dimethylformamide | |||
Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
Ethanol – 190 Proof | |||
Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |