Dit artikel presenteert een efficiënte methode om myocardiale ischemie en de daaropvolgende chronische reperfusie bij ratten uit te voeren met behulp van een minimaal invasieve aanpak. Bovendien wordt de linker ventriculaire hemodynamische functie van ratten beoordeeld door echocardiografie en geïsoleerde werkhartmethoden.
Myocardinfarct (MI) blijft wereldwijd de belangrijkste bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit. Daarom is onderzoek naar dit onderwerp verplicht. Een gemakkelijk en zeer reproduceerbare MI inductieprocedure is vereist om meer inzicht en beter begrip van de onderliggende pathologische veranderingen te verkrijgen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de effecten of potentie van nieuwe en veelbelovende behandelingen (als geneesmiddelen of interventies) bij acute MI, latere remodellering en hartfalen (HF) te evalueren. Na intubatie en pre-operatieve voorbereiding van het dier werd een verdovingsprotocol met isoflurane uitgevoerd en werd de chirurgische ingreep snel uitgevoerd. Met behulp van een minimaal invasieve aanpak, de linker voorste aflopende slagader (LAD) werd gelokaliseerd en afgesloten door een ligatuur. De occlusie kan acuut worden uitgevoerd voor latere reperfusie (ischemie/reperfusieletsel). Als alternatief kan het vat permanent worden geligat om de ontwikkeling van chronische MI, remodelleren of HF te onderzoeken. Ondanks de gemeenschappelijke valkuilen zijn de uitvalpercentages minimaal. Verschillende behandelingen zoals remote ischemische conditionering kunnen worden onderzocht op hun cardioprotectieve potentieel pre-, peri- en postoperatief. Het postoperatieve herstel was snel omdat de anesthesie nauwkeurig werd gecontroleerd en de duur van de operatie kort was. Postoperatieve analgesie werd toegediend voor drie dagen. De minimaal invasieve procedure vermindert het risico op infectie en ontsteking. Bovendien vergemakkelijkt het een snel herstel. De “werkende hart” metingen werden uitgevoerd ex vivo en maakte nauwkeurige controle van preload, afterload en flow. Deze procedure vereist specifieke apparatuur en training voor adequate prestaties. Dit manuscript biedt een gedetailleerde stapsgewijze inleiding voor het uitvoeren van deze metingen.
Hoewel de incidentie voortdurend afneemt, is een acuut hartinfarct (MI) nog steeds de belangrijkste bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit wereldwijd1. Er zijn beperkingen op de evaluatie van de werkzaamheid van potentiële behandelingen als geneesmiddelen of chirurgische ingrepen die acute MI voorkomen en behandelen. Voordat de effecten ervan bij de mens kunnen worden onderzocht, moeten deze behandelingen vooraf worden getest op risico’s, waaronder in vivo onderzoeken bij dieren. Er is geen betere gelegenheid om een pathologie te bestuderen dan onder in vivo omstandigheden. Daarom maakt MI-inductie bij ratten of muizen en zelfs grote diermodellen (varkens of schapen) het onderzoek mogelijk naar korte- (acute) en langdurige (chronische) veranderingen als gevolg van ischemie in de kransslagaders en het omliggende myocardium, evenals systemische veranderingen als gevolg van verminderde hartfunctie. Infarct grootte was voorheen het belangrijkste doel, maar meer recent daaropvolgende cardiale remodellering processen in acute MI of ischemie / reperfusie letsel evenals in opeenvolgende hartfalen (HF) zijn geworden van groot belang. Daarom is een vergelijkbare en gemakkelijk reproduceerbare methode nodig om consistente resultaten te bereiken.
Terwijl het gebruik van cryo-ablatie te krijgen MI is gemeld2, onze methode bouwt voort op andere studies waarin onderzoekers occlude de linker voorste aflopende slagader (LAD) door een enkele steek ligatie. In vergelijking met (hemi-)sternotomieprocedures maakt de minimaal invasieve aanpak die in dit artikel zal worden gepresenteerd, een sneller postoperatieve herstel mogelijk en vermindert de werkingstijd aanzienlijk. Een veel voorkomende stap van andere chirurgische ingrepen is de lift-out van het hart van de thorax om het hart steek3uit te voeren. De aanpak van deze methode maakt deze stap overbodig. Afhankelijk van het protocol kunnen twee verschillende procedures worden uitgevoerd: een tijdelijke occlusie met behulp van een tourniquet om ischemie/reperfusie over een bepaalde tijd te induceren; of een permanente occlusie van de slagader door de ligatuur te bevestigen. Het succes van occlusie kan worden geëvalueerd met elektrocardiogram (ECG) en de macroscopische veranderingen in de linker ventrikel (LV) evenals de verlamming.
Een andere belangrijke stap voorafgaand aan de operatie is intubatie. Terwijl in de meeste gevallen intubatie wordt uitgevoerd via tracheotomie of via orale inbrengen van de buis onder visie door een huidincisie bij de keel, beschrijft dit protocol de endotracheale intubatie van het verdoofde dier dat ademhalingsproblemen of infecties postoperatiefvermindert 4,5. Om postoperatieve complicaties te voorkomen, wordt lucht via een spuit uit de thorax verwijderd voordat de borst wordt gesloten.
De tweede taak van dit artikel is de evaluatie van de hemodynamische functie via een geïsoleerd werkhart experimenteel model, hoe het wordt gebruikt in andere projecten binnen ons instituut6,7. Terwijl echocardiografie, cardiale magnetische resonantie imaging (MRI) en invasieve kwantificering van drukvolume lussen zijn bekende en veel gebruikte methoden om de cardiale functie in vivo te beoordelen, ze zijn bekend dat sommige beperkingen hebben. Invasieve benaderingen, zoals het gebruik van katheters om de globale functie of specifieke parameters van het hart te onderzoeken, worden vaak gebruikt en vertegenwoordigen de gouden standaard van hartmetingen. Het ex vivo werkhartapparaat daarentegen wordt zelden gebruikt vanwege de complexiteit en kosten. Er zijn vele belangrijke aspecten, van het mengsel van het uitfuis tot de adequate cannulatie van het hart, die cruciaal zijn voor een succesvolle evaluatie. Het geïsoleerde werkende hartapparaat werd in 1897 voor het eerst beschreven door Oskar Langendorffen is in de afgelopen decennia gewijzigd9. Vandaag de dag zijn er twee modellen gebruikt: de Langendorff (LD) modus en de working heart (WH) modus. In onze studie wordt de LD-modus gebruikt om het hart te acclimatiseren aan zijn nieuwe omgeving (ongeveer 15 min). In deze modus wordt het hart cannulated via de aorta en de kransslagaders zijn geperfundeerd anterogradely, voldoende leveren van de myocardium. In de LD-modus voert het hart geen drukvolumewerk uit. In de WH-modus daarentegen wordt het linkeratrium cannulated via een longader, waardoor het perfusate het linkeratrium binnenkomt. Het hart pompt dit vervolgens fysiologisch tegen een vooraf gedefinieerde afterload. Door de afterload na verloop van tijd te verhogen, kan de hartfunctie continu worden gemeten. Parameters zoals coronaire stroom, cardiale output (CO), slagvolume (SV) en werk, atriumstroom en LV-systolische en diastolische druk kunnen worden gemeten. De impact van verschillende behandelingen direct en uitsluitend op het hart kan worden onderzocht6,10. Een beoordeling door Liao en Podesser9 presenteerde het wijdverbreide gebruik van deze methode bij de evaluatie van farmacologische effecten op de hartfunctie en metabolisme, alsmede bij de exploratie van verschillende ziekten zoals MI, HF, obesitas en diabetes.
Samengevat presenteert dit protocol een reproduceerbare methode om MI- of myocardiale ischemie/reperfusie (MIR) letsel in vivo uit te voeren. Bovendien, het laat de karakterisering van LV (dys-)functie op een geïsoleerd rattenhart na MI. Dit protocol presenteert een unieke combinatie van behandeling en analyse.
Negatieve verbouwing post-MI wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme in de ontwikkeling van hartfalen. Om de continuïteit van cardiovasculair onderzoek te waarborgen, moeten daarom experimentele procedures en technieken reproduceerbaar zijn. Een begrijpelijk en duidelijk omschreven experimenteel protocol is een fundamenteel element van reproduceerbaarheid. Reproduceerbaarheid verwijst naar resultaten die door meerdere wetenschappers kunnen worden herhaald en die in verschillende laboratoria worden gevalideerd. Deze studie was bedoeld om een semi-minimaal invasieve methode te presenteren om chronische of opnieuw geperfundeerde MI te induceren en de cardiale hemodynamische functie bij ratten te beoordelen.
Deze resultaten en verder gepubliceerde gegevens tonen de hoge potentie van deze chirurgische methode en het belang ervan in onderzoek naar MI, remodelleren en HF. Terwijl ischemie/reperfusie letsel kan worden gebruikt om de veranderingen in MI met latere reperfusie te begrijpen, permanente occlusie maakt een beter begrip van de korte en lange termijn remodellering processen van het myocardium. Andere chirurgische benaderingen veroorzaken meer weefselschade en dieren vertonen hogere risico’s op het ontwikkelen van infecties en pneumothorax, wat resulteert in hogere uitvalpercentages. Deze procedure is daarentegen bedoeld om de mortaliteit te verminderen door specifieke verbeteringen in de opzet en behandeling. Bovendien vertonen ze variaties in fibrotische littekenuitbreiding als gevolg van instabiele LAD occlusie.
Ons protocol biedt een eenvoudige methode voor intubatie, wat een van de meest kritieke stappen van de hele procedure is. In tegenstelling tot diverse andere publicaties12wordt tracheotomie niet uitgevoerd in onze procedure. Dit verbetert het ontwaken en de revalidatie van de dieren postoperatief, wat leidt tot de ontwikkeling van de pathofysiologische veranderingen die door deze chirurgische ingreep zijn bedoeld voordat de dieren postoperatieve metingen ondergaan. Uiteraard, als het een niet-overlevingsprotocol is, wordt tracheotomie uitgevoerd onder visie en is het dus gemakkelijker uit te voeren. Bovendien is het sluiten van de tracheotomie in een overlevingsprotocol niet van toepassing. Als de thorax wordt geopend, is het verplicht om de long te ventileren om instorting te voorkomen. Daarom worden de ratten geïntubeerd voorafgaand aan de chirurgische ingreep. De minimaal invasieve aanpak snijdt de ribben of het borstbeen niet waardoor de compactheid en stabiliteit van de thorax behouden blijft. Bijgevolg wordt het herstel van de dieren verbeterd en is het risico op spontane pneumothorax of bloedingen relatief laag.
Zoals eerder vermeld, terwijl de intubatie is van duidelijk voordeel, het is moeilijk uit te voeren en kan leiden tot een hogere drop-out rate aan het begin van de experimenten. Dit probleem kan worden beperkt met training en wat anatomische kennis. Het is belangrijk om de buis in de juiste hoek te plaatsen en het lichaam van het dier uit te rekken totdat het licht door de vocale lippen schijnt waarna de buis voorzichtig naar voren kan worden geduwd. Zorg ervoor dat de vocale lippen niet schadelijk zijn, omdat dit zwelling kan veroorzaken, daaropvolgende occlusie van de glottis en verstikking.
Het is ook belangrijk dat de LAD correct wordt geligat. Het kleine chirurgische raam, het snel kloppende hart en de geventileerde long (raak het niet zoveel mogelijk aan, omdat elk contact kan leiden tot bloedingen in de long) maken het vat niet duidelijk zichtbaar. Daarom is anatomische kennis onmisbaar. De linker oorschelp is onmisbaar om zowel het risicogebied te standaardiseren als de ligatie rond de LAD te positioneren. De steek moet intramuraal worden uitgevoerd, niet transmuraal in de LV, omdat dit een vermindering van de LV-kamerdiameter en het volume kan veroorzaken die niet te wijten is aan de pathologische processen. Succesvolle occlusie wordt geassocieerd met cyanose van het myocardgebied in gevaar en verhoging van het ST-segment op ECG. De belangrijkste beperking van deze procedure is de juiste positionering van de hechting. Om vergelijkbare resultaten te bereiken, moeten de steken op hetzelfde niveau zijn en moeten vergelijkbare hoeveelheden weefsel worden gebruikt. Dit vereist een hoog opleidingsniveau en de verschillende gewichten van de dieren moeten in aanmerking worden genomen. Een ander punt om te overwegen is de adequate verwijdering van de pneumothorax voorafgaand aan de sluiting van de intercostale ruimte. Als dit niet precies wordt uitgevoerd, zullen de dieren ademhalingsproblemen vertonen, omdat de inflatie van de linkerlong wordt belemmerd door een pneumothorax. Zoals eerder vermeld, kan dit worden verzacht door het gebruik van een spuit om eventuele restlucht te verwijderen uit de thorax.
Momenteel is deze MI-procedure een veelgebruikte methode die vergelijkbare resultaten en een hoge overlevingskans garandeert als de kritieke stappen met hoge precisie worden uitgevoerd. Toekomstige projecten op verschillende behandelingen, apparaten of geneesmiddelen in MI, HF of cardiale remodellering kunnen worden geëvalueerd door het uitvoeren van deze minimaal invasieve techniek.
De WH-metingen worden, zoals eerder vermeld, niet vaak gebruikt omdat het onderhoud en de behandeling ervan specifieke apparatuur en kennis vereist. Om representatieve en vergelijkbare gegevens te verkrijgen, moeten valkuilen worden vermeden. De meest kritieke stappen zijn de montage van het hart en het overschakelen van het D-model naar de WH-modus. Als het hart niet voldoende wordt uitgesneden, kan de montage moeilijk zijn omdat voldoende aortaweefsellengte nodig is om het hart aan het apparaat te bevestigen. Kort na het aansluiten op de LD-modus kan de hartfrequentie afnemen als gevolg van het wassen in koude buffer, de ontkoppeling van de fysiologische stimuli in het lichaam of de reperfusie met bloed van een andere soort door het apparaat. In dergelijke gevallen moet een pacemaker worden toegepast om de fysiologische frequentie te herstellen en te behouden. Dit zorgt voor vergelijkbare resultaten bij alle dieren. Aangezien het bloedvolume in het apparaat een veelvoud is van het fysiologische volume bij ratten, worden runderrode bloedcellen in een op Krebs-Henseleit buffer gebaseerde suspensie gebruikt.
De overstap van de LD-modus naar de WH-modus is synoniem voor een overstap van passief naar actief hartwerk. De LD-modus wordt gebruikt om het hart te wennen aan zijn nieuwe omgeving. In de WH-modus moet het hart zijn fysiologische uitwerpfuncties uitvoeren. Daarom is een korte aanpassingsfase aan de nieuwe omstandigheden vereist vóór de evaluatie door het verhogen van de afterload.
Een andere kritieke stap die vaak wordt vergeten is de adequate voorbereiding en het onderhoud van het apparaat en het uitfuideren. Het precieze volume van elke verbinding moet worden gemengd en de temperatuur in het systeem moet worden geregeld en aangepast. Niettemin is de WH een elegante methode om cardiale output, slagvolume, linker ventriculaire systolische druk en coronaire stroom tegelijkertijd te beoordelen.
Deze zeer reproduceerbare procedure om MI te induceren en de vertegenwoordigende gegevens die door het WH-apparaat zijn verkregen, bewijzen zelf hun vermogen. De semi-minimaal invasieve aanpak, het niveau van LAD occlusie en intubatie methode vergemakkelijken snel herstel en lage variabiliteit in infarct grootte. Bovendien, cardiale functie analyse in geïsoleerde werkende harten bieden waardevolle hemodynamische resultaten.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken het operationeel theaterteam en technici van het Center for Biomedical Research voor hun bijdrage, technische bijstand, waardevolle input en advies. De projecten worden gefinancierd door het Ludwig Boltzmann Instituut, Cluster for Cardiovascular Research (REM-project).
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |