Представлен протокол, сочетающий очистку тканей с световой микроскопией флуоресценции листа (LSFM) для получения трехмерных и клеточных изображений разрешения лимфатических сосудов и лимфатических узлов (НН), собирающих спинномозговой жидкости (CSF) и спинномозговой эпидуральной жидкости.
Лимфатическая система, связанная с центральной нервной системой (ЦНС), включает в себя лимфатические сосуды, которые вращаются вокруг мозга, спинного мозга и связанных с ним LNs. ЦНС-ассоциированной лимфатической системы участвует в дренаже CSF макромолекулы и менингеальные иммунные клетки к ЦНС-дренажных LNs, тем самым регулируя очистку отходов и иммунного наблюдения в тканях ЦНС. Представлен новый подход для получения трехмерных (3D) и клеточного разрешения изображения CNS-ассоциированных лимфатических при сохранении целостности их схем в окружающих тканях. Протокол iDISCOиспользуется для иммунолабелевых лимфатических сосудов в декальсифицированных и очищенных целых крепостей позвоночного столба, которые впоследствии изображя с помощью светового листа флуоресценции микроскопии (LSFM). Техника показывает 3D структуру лимфатической сети, соединяющей менингеальные и эпидуральные пространства вокруг спинного мозга к внепозвоночным лимфатическим сосудам. Предусмотрены 3D-изображения дренажных схем молекулярных трассировщиков, ранее введенных либо в CSF через цистерна-магну, либо в тораколумбарную спинномозговую паронхиму. Подход iDISCO/LSFMоткрывает беспрецедентные возможности для изучения структуры и функции лимфатической системы, связанной с ЦНС, в нейрососудистой биологии, нейроиммунологии, раке мозга и позвонков, или биологии позвоночных костей и суставов.
ЦНС окружен CSF и наложения слоев очинок, эпидуральной ткани и костей. В целом, CSF обеспечивает физическую защиту мягкого мозга и спинного мозга. В основном выделяется сосудистое сплетение и менингеальные мембраны (т.е. пиа-матер, арахноид и дура-матер). CSF-менингеальный комплекс также устанавливает функциональный интерфейс между тканями ЦНС и остальной частью тела, тем самым способствуя Гомеостазу ЦНС. Во-первых, CSF проникает в СНС parenchyma через ЦНС пара-артериальных пространств и динамически взаимодействует с интерстициальной жидкости (ISF)1 через глимфатический (glia-лимфатический) системы, которая состоит из параваскулярных пространств и астроцитов конечной ноги мембраны вокруг сосудов ЦНС2,3,4. Метаболические отходы и избыток жидкости затем в конечном счете очищается от внутримурного периваскулярного дренажа непосредственно из мозга parenchyma к системной циркуляции3, а также паравенные пространства к CSF и через мозг-дренаж лимфатических сосудов, в соответствии с глимфатической модели2,4. Отток CSF в основном через лимфатическую систему, через крибриформную пластину и связанные с ними внекраниальные лимфатические сосуды5,,6,,7,а также менингеальные лимфатические сосуды, которые сходятся в мозго-дренажных LNs8,9,10,11,12 (Рисунок 1). Важную, хотя и второстепенную, роль в оттоке CSF играет черепно-мозговая арахноидная вилли, которая проникает в лакуну менингеальных венозных пазух13.
CFS дренажные цепи были тщательно исследованы с помощью экспериментальных подходов, основанных на инъекциях цветных / флуоресцентных трассировщиков в ЦНС или CSF, а затем изображением шаблона трассировщиков внутри ЦНС и по всей части органов и тканей тела в разные временные точки после инъекции13. Долгое время отток CSF считался исключительно и непосредственно принятым ответственным за кровообращение, через арахноидальную вилли, проецирующуюся в дуальные венозные пазухи13. Тем не менее, отток CSF в основном осуществляется лимфатической сосуды, как недавно показали ближнего инфракрасного (NIR) динамическое изображение CSF-инъекционных трассировщик транспорта у мышей9,10. CSF-дренажных лимфатических сосудов затем вернуть лимфы в кровоток через правую подклавиевскую вену. Дополнительные приближения обнаружили как экстракраниальные6,,7,,13 и внутричерепные9,10,11,,12 лимфатических выходов CSF-инъекционных трассировщиков и предположить, что CSF поглощается двумя лимфатическими путями, один внешний, а другой внутренний к черепу и позвоночной колонке. Основная часть дренажа CSF быстро происходит через лимфатические сосуды, расположенные ростралически, вне черепа в слизистой оболочке носа, через каналы крибриформной пластины этилоидной кости3,,6,,13 и, по-настоящему, вне люмбосакральных костей позвонков через дорсо боковой линии, которые еще не полностью охарактеризованы7,,14. Кроме того, в оболочках черепа, лимфатические капилляры dura mater directy поглощают CSF и менингеальные иммунные клетки к дуральным лимфатическим коллекторам, которые пересекают кости черепа и подключаются к ЦНС-дренажных LNs12,14. Эти менингеальные лимфатические сосуды играют важную роль в патофизиологии ЦНС, потому что менингеальная лимфатическая опухоль мозга изменяется при старении, а также влияют на исход неврологических заболеваний головного мозга, включая нейродегенерацию, нейровоспаление и рак мозга15,,16,17. Таким образом, ЦНС-ассоциированных лимфатических сосудов (т.е. дуральных и периферических лимфатических сосудов, осушенных CSF) может быть перспективным новой мишенью для борьбы с болезнями ЦНС у людей.
Конвергентные исследования, проведенные с иммуногистологией и магнитно-резонансной томографией высокого разрешения, показали, что менингеальная лимфатическая вазулатура также существует у приматов, в том числе обычных сурков и людей7,,11,13. Кроме того, менингеальные лимфатические сосуды не ограничиваются черепом, но распространяются в позвоночном столбе на поверхность спинного ганглиев и рами13,,18. Трехмерная (3D) визуализация позвоночного столба лимфатических сохранения общей анатомии помеченных образцов позвонков и позвоночника, в том числе чрезмерной костей, мышц, связок, а также соседних висцеральных тканей, недавно была выполнена14. IDISCOпротокол 19,20 был использован для иммунолабела декалцифицированных и очищенных препаратов всего позвоночного столба с лимфатическими специфическими антителами против либо мембранного рецептора LYVE121 или транскрипционного фактора PROX122. Приобретение изображений и анализ были затем проведены с помощью светового листа флуоресценции микроскопии (LSFM) и программного обеспечения Imaris. LSFM позволяет быстро и минимально инвазивных 3D изображений крупных образцов осевого заключения освещения, что приводит к снижению фотоблесы и фототоксичности23.
Подход iDISCO/LSFMпозволяет охарактеризовать различные слои дураловых и эпидуральных лимфатических сосудов, а также связь этого сосуда с внепозвоночными лимфатическими цепями и LNs, соседствующим с позвоночным столбом. Протокол был применен к тканям, ранее вводившие флуоресцентные трассировщики для демонстрации дренажа позвоночного канала. В настоящем документе содержится+подробная информация о методологии iDISCO /LSFM для изображения лимфатических сосудов позвонка и иллюстрирует его отношение к CSF и эпидуральной жидкости дренаж исследования.
Протокол iDISCO/LSFMобеспечивает беспрецедентное 3D-виды лимфатической сети, связанной с ЦНС, в окружающих ее тканях на клеточном уровне разрешения. Этот протокол хорошо адаптирован к образцам среднего размера, не exeeding 1,5 см3, из-за ограничений оптической системы LSFM, сокращение рабочего расстояния, и большой размер коммерческих объективных линз для микроскопии высокого разрешения23. Это ограничение предотвращает захват всей лимфатической системы, связанной с мозгом. Важно отметить, что область исследования должна быть осторожно делимитированных и тканей, окружающих ЦНС должны быть тщательно расчленены для того, чтобы включить экстракраниальных лимфатических сосудов и LNs, которые способствуют всей лимфатической схемы (Таблица 2).
В дополнение к размеру и анатомическим соображениям, сложность окружающих мезенхимальных тканей варьируется вдоль черепа и позвоночного столба, что требует адаптации декалькации и предварительной очистки для того, чтобы получить однородное уточнение образца и обеспечить распространение светового луча в мягкой изотропной биологической ткани. При отсутствии костей, LFSM визуализации тканей головного или спинного мозга не требует стадии декалькификации, и окончательное разрешение захваченных изображений является оптимальным19. Вышеупомянутый протокол, который включает в себя мягкий шаг декальцификации с решением Морзе, хорошо адаптирован для LSFM изображения позвоночного столба, как показано на рисунке 1 и рисунок 4. В отличие от этого, область шеи отображает особенно сложную анатомию костей в дополнение к нескольким слоям мышц, жира и железистых тканей, которые снижают качество захваченных изображений LSFM, как это отражено в рисунке 3B. Таким образом, LSFM-изображение области шеи и шейки матки может быть улучшено путем более строгого лечения тканей; например, с EDTA, как ранее сообщалось24. Таким образом, шаг декалькификации имеет решающее значение, и условия декалькификации должны быть предварительно протестированы для каждого антитела, используемого перед началом полногопротокола iDISCO(Таблица 2).
В то время+как протокол iDISCO /LSFM позволяет получить 3D-вид соединительных цепей между менингеальными и эпидуральными пространствами и связанными с ними LN, прямой количественный анализ лимфатических сосудов из LSFM-захваченных изображений не представляется возможным по следующим причинам: 1) разграничение лимфатических схем сосудов является ненадежным из-за прерывистой картины лимфатического маркера выражение, потому что membranar LYVE1 является ежетерогно распределены21 и PROX1 имеет ядерную модель выражения22; 2) неоднородное проникновение антител, а также анисотропии, которые могут сохраняться в биологической ткани из-за неполной и неоднородной декалькации и предварительной очистки. Таким образом, изображение LSFM должно быть расширено с помощью инструментов виртуальной реальности, которые позволяют интерактивную визуализацию и тем самым облегчают количественную оценку лимфатической сосудов (www.syglass.io). Примечательно также, что точное описание связанных с ЦНС схем требует резервного копирования информации LSFM с конфокальными данными высокого разрешения, полученными путем обычного иммуномаркирования на тонких (5-10 мкм) криостата или парафин-встроенных секций ткани, особенно для точной локализации положения лимфатических сосудов в отношении dura mater и CSF, как сообщалось ранее11,14,18.
Протокол iDISCO/LSFMпозволяет трехмерную визуализацию макромолекулярного дренажа в лимфатической системе, связанной с ЦНС, как показано на рисунке 3 и на рисунке 4. Тем не менее, функциональная оценка лимфатического дренажа требует, в дополнение к рекомендациям по iDISCO/LSFMпротокол подробно описано выше, после строгой процедуры, как конечный результат зависит от качества инъекционной хирургии, выбор места доставки, тип и вводили объем макромолекула маркера используется, и время жертвоприношения после администрирования трассировщика ( Таблица2). Из-за вариаций схемы трассировки между инъекционными животными, характеристика лимфатических дренажных схем требует больших экспериментальных групп (‘gt;10 по состоянию инъекции). В представленном протоколе, 1) дюра-матер должны быть проколоты перед инъекцией, чтобы предотвратить нежелательные поражения и проникновение в ткани ЦНС; 2) вводимый объем должен быть меньше 2 мл, чтобы ограничить нежелательное диффузию через отверстие для инъекций, вдоль капилляра инъекций, в эпидуральное пространство или экстрапозвоночный ткани; 3) глубина инъекций капиллярной вставки должна быть ограничена 2 мм ниже dura mater, чтобы избежать травмы ЦНС или mistargeting в ICM и интраспинальных инъекций, соответственно. Отметим также, что для оценки наличия инъекций внутри лимфатических сосудов необходимо провести дополнительный конфокальный анализ соседних сегментов позвонков с высоким разрешением. Этот анализ требует установления интенсивности профиль участков для трассировщика и лимфатического маркера на поперечных участках маркера помечены лимфатических сосудов. Этот подход был ранее использован для демонстрации OVA555 поглощения ThLb лимфатических на 15 минут после инъекции (Дополнительный рисунок 5F в Иаков и др.14). Тем не менее, он не был проиллюстрирован для анти-LYVE1 трассировщик в настоящем исследовании (Рисунок 4).
Среди возможных трассировщиков CSF, OVA-A555 является отличным вариантом, поскольку он устойчив кпроцедуре протокола iDISCO и поддерживает высокую флуоресценцию для LSFM изображений. Однако обратите внимание, что тип трассировщика должен быть выбран в соответствии с. точкой времени анализа(Таблица 1 и Таблица 2). Как сообщалось выше, OVA-A555 маркировки местных позвонков лимфатических сосудов наблюдается на 15 мин после инъекции14. Тем не менее, OVA-A555 больше не обнаруживается в этих местных лимфатических цепях на 45 мин после инъекции(рисунок 3) в отличие от анти-LYVE1 антитела(Рисунок 4).
В заключение следует,+что протокол iDISCO /LSFM хорошо адаптирован для исследования 3D-структуры и дренажа лимфатической системы, связанной с ЦНС, в физиологических и патологических состояниях, таких как ЦНС и рак позвонков, или заболевания позвонков и суставов. Хотя полная процедура является длительной и требует методологической строгости, она предоставляет ценную, уникальную информацию при использовании с дополнительным анализом с использованием инструментов виртуальной реальности и конфоцальной визуализации высокого разрешения.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом Санте и де ла Рехерш Медикал, Национальное агентство Рехерче (ANR-17-CE14-0005-03), Федерация за recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (в L.J.), Федеральный университет де Рио-де-Джаньеро (UFRJ для J.B.), NIH (R01EB016629-01) и йельский университет медицины. Мы признаем платформы ICM: ICM-КВАНТ для клеточной визуализации и ИСМ-гистамики для иммуногистохимии. Все работы с животными велись на объекте PHENO-ICMice. Ядро поддерживается 2 “Инвестиции d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 и ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) и “Фонд за recherche M’ddicale”. Мы признательны Николя Ренье за методологические советы и чтение рукописей.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |