Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide d’une analyse cellulaire en temps réel
Summary
Il est rapporté ici un protocole pour la quantification des particules virales infectieuses en utilisant la surveillance en temps réel de l’impédance électrique des cellules infectées. Une application pratique de cette méthode est présentée en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A sous différents paramètres physicochimiques imitant les conditions environnementales.
Abstract
Les méthodes de quantification des particules virales représentent un aspect essentiel de nombreuses études virologiques. Bien qu’il existe plusieurs techniques fiables, elles prennent beaucoup de temps ou sont incapables de détecter de petites variations. Présenté ici est un protocole pour la quantification précise du titre viral en analysant les variations d’impédance électrique des cellules infectées en temps réel. L’impédance cellulaire est mesurée à l’aide de biocapteurs à microélectrodes d’or situés sous les cellules dans des microplaques, dont l’ampleur dépend du nombre de cellules ainsi que de leur taille et de leur forme. Ce protocole permet une analyse en temps réel de la prolifération, de la viabilité, de la morphologie et de la migration cellulaires avec une sensibilité accrue. Un exemple d’application pratique est également fourni en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A (VAI) soumise à divers paramètres physicochimiques affectant l’infectiosité virale au fil du temps (c.-à-d. température, salinité et pH). Pour de telles applications, le protocole réduit la charge de travail nécessaire tout en générant des données de quantification précises des particules virales infectieuses. Il permet de comparer les pentes d’inactivation entre différents IAV, ce qui reflète leur capacité à persister dans un environnement donné. Ce protocole est facile à réaliser, est hautement reproductible et peut être appliqué à tout virus produisant des effets cytopathiques en culture cellulaire.
Introduction
La transmission d’un virus repose sur la combinaison de plusieurs facteurs. Pour un virus sécrété dans l’environnement, sa transmission dépend également de sa capacité à persister dans des conditions extérieures à l’hôte. L’étude de l’inactivation virale en général est donc une étape cruciale pour aider les autorités sanitaires nationales et les décideurs politiques à mettre en œuvre des mesures de contrôle et de biosécurité.
Les connaissances sur la persistance du virus dans les milieux naturels et de laboratoire ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Dans le cas des virus de la grippe A (IAV), leurs voies de transmission soumettent les particules virales à un large éventail de conditions environnementales. Plus précisément, ils peuvent être transmis par 1) voies fécales-orales par l’eau (c.-à-d. les virus aviaires), ou 2) par contact direct ou indirect par des fomites contaminés, ainsi que par des aérosols et des gouttelettes respiratoires (c.-à-d. des virus de volaille et de mammifères)1. Dans tous les cas, les IAV sont soumis à divers paramètres physico-chimiques (p.a., salinité, température et humidité), ce qui affecte plus ou moins rapidement leur infectiosité2,3,4,5,6,7,8,9. Il est très important, en particulier en ce qui concerne les virus zoonotiques et pandémiques, d’évaluer le potentiel des facteurs environnementaux à affecter la dynamique du virus et les risques d’exposition et de transmission interspécifique.
Jusqu’à présent, des techniques virologiques traditionnelles (c.-à-d. la détermination du titre viral par des essais de plaque ou l’estimation de la dose infectieuse par culture tissulaire à 50 %) ont été utilisées pour évaluer l’infectiosité de l’IAV au fil du temps; mais ces techniques prennent beaucoup de temps et nécessitent de nombreux approvisionnements10,11,12. La mesure de l’impédance des cellules infectées au fil du temps avec des microélectrodes est un outil utile pour surveiller la survie aux MII dans différentes conditions environnementales, ainsi que l’inactivation virale en général. Cette méthode fournit des données objectives en temps réel qui remplacent l’observation humaine subjective des effets cytopathiques. Il peut être utilisé pour déterminer le titrage du virus, remplaçant ainsi les mesures traditionnelles par des intervalles de confiance plus faibles et évitant les tests d’évaluation à forte intensité de main-d’œuvre.
Il existe une corrélation linéaire entre les résultats de titrage obtenus par mesure de l’impédance cellulaire et par les méthodes classiques de dosage de la plaque ou TCID50. Par conséquent, les données obtenues avec la méthode de titrage basée sur l’impédance peuvent être facilement transformées en valeurs TCID50 ou pfu en créant une courbe standard avec dilution en série du virus13,14,15,16,17. La détection, la quantification et l’efficacité des anticorps neutralisants présents dans les échantillons de sérum peuvent également être obtenues à l’aide de cette approche expérimentale18,19. Plus récemment, des tests cellulaires basés sur l’impédance ont été utilisés pour dépister et évaluer les composés antiviraux contre les alphaherpèsvirus Equid20.
Cette technologie a été utilisée pour évaluer la persistance des IAV dans l’eau saline à différentes températures et pour identifier les mutations dans l’hémagglutinine de l’IAV qui augmentent ou diminuent la persistance de l’IAV dans l’environnement21. Un tel dépistage nécessiterait un travail approfondi s’il utilisait des méthodes de titrage traditionnelles. Cependant, cette méthodologie peut être utilisée pour tout virus qui a un impact sur la morphologie cellulaire, le nombre de cellules et la force d’attachement de la surface cellulaire. Il peut également être utilisé pour surveiller la persistance dans diverses conditions environnementales (c.-à-d. dans l’air, dans l’eau ou sur les surfaces).
Le protocole décrit ici applique la survie IAV dans l’eau à titre d’exemple. Les virus de la grippe humaine sont exposés à différents paramètres physico-chimiques pendant de longues périodes. L’eau saline (35 g/L de NaCl) à 35 °C a été choisie comme modèle environnemental sur la base des résultats précédents9. L’infectiosité résiduelle des virus exposés est quantifiée à différents moments par le biais de l’infection cellulaire. Les cellules MDCK, le type de cellule de référence pour l’amplification IAV, sont ensemencées sur 16 plaques de microtitrage de puits recouvertes de capteurs à microélectrodes et infectées par des virus exposés 24 heures plus tard. L’impédance cellulaire est mesurée toutes les 15 minutes et exprimée sous la forme d’une unité arbitraire appelée indice cellulaire (IC). Les effets cytopathiques induits par le virus de la grippe, dont le taux d’apparition dépend directement du nombre de particules virales infectieuses inoculées à la culture cellulaire, entraînent une diminution de l’IC, qui est ensuite quantifiée comme la valeur CIT50 . Cette valeur correspond au temps nécessaire pour mesurer une réduction de 50 % par rapport à l’IC initial (c.-à-d. avant l’ajout du virus). Les valeurs CIT50 calculées pour plusieurs temps d’exposition environnementale permettent de déduire la pente d’inactivation d’un virus après régression linéaire des valeurs CIT50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
RtCA est une technologie basée sur l’impédance qui est de plus en plus utilisée pour la surveillance en temps réel des propriétés cellulaires, telles que l’adhérence cellulaire, la prolifération, la migration et la cytotoxicité. Dans cette étude, la capacité de cette technologie à évaluer la survie de la VAI à l’extérieur de l’hôte est démontrée en mesurant la pente d’inactivation du virus. Les techniques fastidieuses telles que TCID50 et les tests de plaque sont remplacées par une…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
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