Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.
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Methodenartikel
Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die korrekte Faltung und Montage von Proteinen und Proteinkomplexen ist für die Zellfunktion unerlässlich. Zellen verwenden Qualitätskontrollwege, die beschädigte Proteine korrigieren, sequestrieren oder eliminieren, um ein gesundes Proteom zu erhalten, wodurch die zelluläre Proteostase sichergestellt und weitere Proteinschäden verhindert werden. Aufgrund redundanter Funktionen innerhalb des Proteostase-Netzwerks führt das Screening auf nachweisbare Phänotypen mittels Knockdown oder Mutationen in Chaperon-kodierenden Genen im Vielzellorganismus Caenorhabditis elegans in den meisten Fällen zum Nachweis von geringfügigen oder keinen Phänotypen. Wir haben eine gezielte Screening-Strategie entwickelt, um Chaperone zu identifizieren, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, und so die Lücke zwischen Phänotyp und Funktion zu schließen. Insbesondere überwachen wir neuartige Chaperon-Interaktionen mit RNAi-synthetischen Interaktionsbildschirmen, die die Chaperonexpression nacheinander bei Tieren niederschlagen, die eine Mutation in einem Chaperon-kodierenden Gen tragen oder ein Chaperon von Interesse überexpressieren. Indem wir zwei Chaperone stören, die einzeln keinen groben Phänotyp aufweisen, können wir Chaperone identifizieren, die einen bestimmten Phänotyp verschlimmern oder freilegen, wenn beide gestört sind. Wir zeigen, dass dieser Ansatz bestimmte Gruppen von Chaperonen identifizieren kann, die zusammen funktionieren, um die Faltung eines Proteins oder von Proteinkomplexen zu modulieren, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind.
Einleitung
Zellen bewältigen Proteinschäden durch den Einsatz von Qualitätskontrollmaschinen, die beschädigte Proteine reparieren, sequestrieren oder entfernen1,2. Die Faltung und Montage von Proteinkomplexen wird durch molekulare Chaperone unterstützt, eine vielfältige Gruppe hochkonservierter Proteine, die beschädigte Proteine reparieren oder sequestrieren können3,4,5,6,7. Die Entfernung geschädigter Proteine wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)
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Protokoll
1. Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedienplatten für RNAi
- Zu einer 1 L Flasche 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g Agar und destilliertes Wasser bis 1 L und Autoklav geben.
- Flasche auf 55 °C abkühlen.
- Fügen Sie 25 ml 1 MKH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4und 1 ml Cholesterinlösung (Tabelle 1) hinzu, um Nematodenwachstumsmedien (NGM) herzustellen.
- Fügen Sie 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 0,5 ml 1 M IPTG(Tabelle 1)hinzu, um NGM-RNAi-Lösung herzustellen.
HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli-Bakterien enthalten eine IPTG-....
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Ergebnisse
Verwendung temperaturempfindlicher Mutationen in UNC-45 zum Screening auf verschlimmernde oder lindernde Wechselwirkungen unter freizügigen bzw. restriktiven Bedingungen
Muskelaufbau und -erhaltung bieten ein effektives System zur Untersuchung gewebespezifischer Chaperon-Interaktionen. Die Funktionelle Einheit der kontraktilen Muskeln, das Sarkomer, stellt eine kristalline Anordnung von strukturellen und regulatorischen Proteinen dar. Die Stabilität des Motorproteins Myosin und sein Einbau in die dick.......
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Diskussion
Ein integriertes Bild des Proteostase-Netzwerks, das widerspiegelt, wie es in verschiedenen Metazoenzellen und -geweben organisiert ist und funktioniert, fehlt weiterhin. Um dieses Manko zu beheben, sind spezifische Informationen über die Wechselwirkungen verschiedener Komponenten dieses Netzwerks, wie z.B. molekulare Chaperone, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und Alterung erforderlich. Hier zeigten wir, wie die Verwendung von gewebespezifischen Störungen es uns ermöglichte, das Chaperonnetzwerk in einem b.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird, für einige der Nematodenstämme. Monoklonale Antikörper, die von H.F. Epstein entwickelt wurden, wurden aus der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wurde. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (Stipendium Nr. 278/18) und durch ein Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Ministeriums für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, Gen....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12-Well-Platten | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm Platten | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm Platten | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-Well-Platten | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128,0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| Bromphenol blau | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Kamera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterin | Amresco | 0433-250G | |
| Konfokal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0,22 &Mikro; m) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluoreszierendes Stereomikroskop | Leica | MZ165FC | |
| Glycerin | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Geschenk aus dem Morimoto Labor |
| Myosin MHC A (MYO-3) Antikörper | Hybridom Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4· 7H2 | O Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Pepton | Merck | 61930705001730 | |
| Plattengießpumpe | Integra | macht es p920 | |
| RNAi Chaperon-Bibliothek | NA | ||
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß- mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| Stereomikroskop | Leica | MZ6 | |
| Tetracyclin | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
Referenzen
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
