Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

Summary

Ce travail présente une méthode de microscopie qui permet l’imagerie en direct d’une seule cellule d’Escherichia coli pour l’analyse et la quantification du comportement stochastique des circuits génétiques synthétiques.

Abstract

Le protocole développé ici offre un outil pour permettre le suivi informatique de la division Escherichia coli et des niveaux fluorescents sur plusieurs heures. Le processus commence par le dépistage des colonies qui survivent sur un minimum de médias, en supposant que seul Escherichia coli hébergeant le plasmide correct sera en mesure de prospérer dans les conditions spécifiques. Étant donné que le processus de construction de grands circuits génétiques, nécessitant l’assemblage de nombreuses parties d’ADN, est difficile, les composants du circuit sont souvent répartis entre plusieurs plasmides à différents numéros de copie nécessitant l’utilisation de plusieurs antibiotiques. Les mutations dans le plasmide peuvent détruire la transcription des gènes de résistance aux antibiotiques et interjecter avec la gestion des ressources dans la cellule menant à la nécrose. La colonie sélectionnée est fixée sur une boîte de Pétri à fond de verre et quelques plans de mise au point sont sélectionnés pour le suivi de la microscopie dans les domaines lumineux et fluorescents. Le protocole maintient la mise au point de l’image pendant plus de 12 heures dans des conditions initiales qui ne peuvent pas être réglementées, créant quelques difficultés. Par exemple, les cellules mortes commencent à s’accumuler dans le champ de concentration des lentilles après quelques heures d’imagerie, ce qui provoque l’accumulation de toxines et le signal de flou et de décomposition. L’épuisement des nutriments introduit de nouveaux processus métaboliques et entrave la réponse souhaitée du circuit. La température de l’expérience abaisse l’effectivité des inducteurs et des antibiotiques, ce qui peut endommager davantage la fiabilité du signal. Le gel média minimal rétrécit et sèche, et par conséquent la mise au point optique change au fil du temps. Nous avons développé cette méthode pour surmonter ces défis dans Escherichia coli, similaire aux travaux précédents développant des méthodes analogues pour d’autres micro-organismes. En outre, cette méthode offre un algorithme pour quantifier le bruit stochastique total dans les cellules inchangées et altérées, constatant que les résultats sont compatibles avec les prédictions de l’analyseur de flux comme le montre un coefficient de variation similaire (CV).

Introduction

La biologie synthétique est un domaine multidisciplinaire qui a émergé au cours de la dernière décennie et vise à traduire les principes de conception d’ingénierie en conception biologique rationnelle^1,2,3, dans un effort pour atteindre l’intégration multi-signaux et le traitement dans les cellules vivantes pour comprendre la science fondamentale^4,5, diagnostic, thérapeutique et biotechnologique applications^6,7,8,9,10. Notre capacité à quantifier la réponse intrant-sortie des circuits génétiques synthétiques a été révolutionné par les progrès récents de la technologie unicell cellules, y compris l’analyseur de flux et l’imagerie cellulaire vivante à l’aide de la microscopie automatisée time-lapse¹¹. Un analyseur de flux est souvent utilisé pour mesurer la réponse de ces circuits à^{l’état stable 1,12}, et la microscopie inversée est utilisée pour mesurer la réponse dynamique des circuits génétiques synthétiques au niveau d’une seule cellule³. Par exemple, l’un des premiers travaux en biologie synthétique a impliqué la construction de réseaux d’oscillateurs génétiques dans les cellules vivantes à l’aide de boucles de rétroaction négatives avec^{un retard de 3}. Plus tard, les circuits oscillateurs génétiques ont été appliqués pour comprendre le contrôle métabolique dans l’environnement dynamique des cellules vivantes⁴. La microscopie automatisée en accéléré est une méthode pour caractériser ces circuits. Nous émettons l’hypothèse que les cellules hôtes, Escherichia coli,se synchronisent lors de la formation de micro-colonies, permettant la mesure du signal et le calcul du bruit sans suivre les relations mère-fille exactes.

Le bruit est un aspect fondamental et inhérent des systèmes biologiques qui proviennent souvent de sources multiples. Prenons, par exemple, les réactions biochimiques impliquant des signaux provenant du transport de porteurs aléatoires discrets tels que la diffusion des protéines¹³. Ces signaux se propagent avec des fluctuations aléatoires¹⁴. D’autres sources de bruit sont la disponibilité des ressources, la division cellulaire et les variations des conditions environnementales telles que la température, l’humidité et la pression. Les signaux biologiques qui se propagent dans les circuits génétiques synthétiques ont souvent un rapport signal/bruit très faible (SNR), ce qui perturbe les performances de ces circuits. Par conséquent, la conception des circuits génétiques demeure l’un des aspects les plus difficiles du génie^{génétique 15}. Par exemple, contrairement à la plupart des approches qui ne calculent que l’expression moyenne des gènes (mesurée sur l’ensemble de la population cellulaire), la variance du signal mesuré est prise en compte afin de concevoir un comportement prévisible par le biais de réseaux génétiques^{synthétiques 12}. En tant que tel, les niveaux de variabilité ou de bruit dans l’expression des protéines jouent un rôle dominant dans la conception et la performance des circuits^{génétiques analogiques et numériques 1,16,17}.

De nombreuses approches ont été développées pour quantifier la variabilité cellule à cellule, y compris chez Escherichia coli^3,7,18. Ces méthodes sont souvent utilisées pour étudier l’activation des gènes et les voies métaboliques, mais avec moins d’accent sur l’étude de la dynamique du bruit stochastique, comme la mesure et le démêlage de sources sonores spécifiques, en particulier pour les circuits génétiques dans les cellules vivantes où il s’agit d’un défi^{fondamental 19,20,21}. Plusieurs facteurs, hérités du circuit lui-même (intrinsèques) et dérivés des cellules hôtes (extrinsèques), peuvent perturber la performance continue des circuits génétiques. Dans cet article, nous avons développé un protocole qui vise à quantifier le bruit total dans les cellules d’Escherichia coli, y compris les sources de bruit intrinsèques et extrinsèques^6,22. En quantifiant le bruit total, puis en évaluant le SNR²³, la conception des circuits génétiques peut être améliorée. Cette méthode peut être modifiée pour mesurer séparément des sources sonores indépendantes, en surveillant plusieurs protéines fluorescentes^6,20. Pour le protocole décrit ici, nous maintenez les conditions environnementales bien contrôlées et mesurons continuellement l’activité des cellules sans l’influence de facteurs externes. Nous mesurons le signal des protéines fluorescentes dans les cellules simples au fil du temps et les entions simultanément sous un substrat agarose. Les images qui en résultent sont analysées à l’aide du MATLAB personnalisé du laboratoire.

Idéalement, la mesure continue de l’activité en temps réel des protéines fluorescentes à l’intérieur d’une cellule produira des données précises grâce à la croissance et à la division des cellules. Toutefois, il est difficile d’acquérir de telles données. Cela est dû à la dégradation des protéines fluorescentes, connues sous le nom de photo-blanchiment⁷, quand ils sont exposés aux radiations dans le processus d’excitation. En outre, les cellules Escherichia coli sont également sensibles à l’excitation, ce qui pourrait conduire à la phototoxicité⁷. Les deux émissions limitent la quantité de cadres photo qui peuvent être acquis et le temps entre les acquisitions. Le substrat et les types moyens (p. ex., bouillon de lysogène) utilisés pour faire croître les cellules pendant l’imagerie jouent également un rôle essentiel. Nous recommandons fortement d’utiliser un milieu minimal, ce qui minimise le fond non fluorescent et prolonge le temps de division cellulaire.

De plus, l’échantillon doit être préparé en tenant compte des exigences suivantes (1) Le faible taux de division cellulaire permet des expositions moins fréquentes pour l’imagerie étroite du cycle de division et la réduction de la probabilité de phototoxicité et de photobleaching. Nous avons fixé le temps d’acquisition à environ la moitié du temps prévu de mitose (2) La faible densité cellulaire au début de l’expérience permet une meilleure uniformité et une meilleure traçabilité de la division. La densité cellulaire est affectée par le rapport de dilution des cellules d’Escherichia coli, qui est un paramètre significatif pour le succès de ce protocole et doit être déterminé pour chaque laboratoire. Afin d’établir le ratio, chaque nouvelle souche ou média Escherichia coli utilisé devrait être équipé de graphiques du taux de croissance(figure supplémentaire 1). Un rapport approprié a été atteint si les cellules peuvent se développer sans secousse supplémentaire après une courte incubation à partir d’une densité initiale d’environ_{600 nm} OD = 0,1. Les cellules à cette phase se diviseront selon la température ambiante seulement (3) Restriction du mouvement cellulaire : le mouvement cellulaire dépend fortement de la fermeté du substrat (coussin agarose). La fermeté du substrat dépend de la quantité totale d’agarose et du temps de solidification du gel. Les gels ne peuvent pas être laissés pour se solidifier pendant la nuit à température ambiante, car l’Escherichia coli subira une mitose. D’autres facteurs qui influent sur la stabilité du substrat comprennent la quantité d’eau dans l’échantillon et l’humidité. D’autres questions sont examinées en détail dans les résultats représentatifs. Ce protocole fournit de nombreux détails et se déplace progressivement d’une étape à l’autre. Le protocole offre une longue stabilité pour les expériences d’imagerie et fournit un outil de traitement d’image de base.

Protocol

1. Préparation des médias et de la culture Préparer une solution de stock de 1 000 x carbenicilline (50 mg/mL) ou antibiotique pertinent. . Peser 0,5 g de carbenicilline. Ajouter 10 mL de H2O stérile. Dissoudre complètement. Stériliser le stock de carbenicilline à l’intermédiaire d’un filtre à seringues de 0,22 μm. Aliquot la solution antibiotique et stocker à -20 °C. Pour préparer des assiettes de bouillon de lysogène (LB),…

Representative Results

Le logiciel analyse les images de domaine de champ lumineux qui sont hors-blanc et noir. L’Escherichia coli ressemblera à des formes oblongues noires sur un fond blanc éteint et une plage dynamique de luminance devrait montrer une pointe en son centre (Figure 1). Dans les images fluorescentes, les cellules peuvent avoir un petit halo, mais les cellules individuelles aux formes oblongues peuvent encore être résolues. Un événement de mitose doit d’abord être détecté aprè…

Discussion

Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un protocole qui permet de retracer par ordinateur les cellules vivantes d’Escherichia coli, en suivant les niveaux de division et de fluo sur une période de plusieurs heures. Ce protocole nous permet de quantifier la dynamique stochastique des circuits génétiques d’Escherichia coli en mesurant le CV et le SNR en temps réel. Dans ce protocole, nous avons comparé les comportements stochastiques de deux circuits différents comme le montre la …

Materials

35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD – Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD – Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD – Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation