Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.
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Methodenartikel
Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vom PTPN11 Proto-Onkogen kodierte Src-Homologie 2 (SH2) ist ein wichtiger Vermittler der Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-gesteuerte Zellsignalisierung, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördert. Darüber hinaus wird SHP2 von Immun-Check-Point-Rezeptoren rekrutiert, um die Aktivierung von B- und T-Zellen zu hemmen. Aberrant SHP2 Funktion wurde in die Entwicklung, Progression, und Metastasierung vieler Krebsarten beteiligt. Tatsächlich sind kleine Molekül-SHP2-Inhibitoren kürzlich in klinische Studien zur Behandlung von soliden Tumoren mit Ras/Raf/ERK-Signalwegaktivierung eingetreten, einschließlich Tumoren mit einigen onkogenen Ras-Mutationen. Jedoch, die aktuelle Klasse der SHP2-Inhibitoren ist nicht wirksam gegen die SHP2 onkogene Varianten, die häufig bei Leukämien auftreten, und die Entwicklung von spezifischen kleinen Molekülen, die oncogenic SHP2 zielen, ist das Thema der aktuellen Forschung. Ein häufiges Problem mit den meisten Arzneimittel-Entdeckungskampagnen mit zytosolischen Proteinen wie SHP2 ist, dass die primären Assays, die chemische Entdeckung vorantreiben, oft In-vitro-Assays sind, die nicht über das zelluläre Zielengagement von Kandidatenverbindungen berichten. Um eine Plattform zur Messung des zellulären Zielengagements zu bieten, haben wir sowohl Wildtyp- als auch mutierte SHP2-Zell-Thermoschicht-Assays entwickelt. Diese Assays detektieren zuverlässig die Zielinteraktion von SHP2-Inhibitoren in Zellen. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll dieses Assays zur Verfügung, das ein wertvolles Werkzeug für die Bewertung und Charakterisierung von SHP2-Inhibitoren darstellt.
Einleitung
Tyrosin-Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in den Zellen1,2. Diese posttranslationale Modifikation wird durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) katalysiert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) umgekehrt. Daher führt abnorme PTK- oder PTP-Funktion zu vielen vererbten oder erworbenen menschlichen Krankheiten3,4,5,6. Die Src-homology 2 (SH2) domänenhaltige Phosphatase 2 (SHP2) ist ein weit verbreiteter Nicht-Rezeptor-Typ PTP, der vom Proto-Onkogen....
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Protokoll
1. Herstellung von Zellkultur und Reagenzien
- Formulieren Sie eine 500 ml Flasche Wachstumsmedien mit 10% fetalem Rinderserum, 1x Antibiotikum/Antimicotika, 20 mM HEPES und 1 mM Natriumpyruvat. Bei 4 °C lagern.
- Tauen Sie zelluläre thermische Schichtreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus gefrorenen Original-Lagerflaschen.
- Reagenzien und Puffer als 2 ml Aliquots abgeben und bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Vermeiden Sie Einfrieren/Tauen für die Reproduzierbarkeit und verwenden Sie nur das Volumen des Reagenzes, das für das Assay-Verfahren erforderlich ist.
2. Wachstum und Wartung von HEK293T-Zellen....
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Ergebnisse
Das thermische Gradientenexperiment für SHP2-WT führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch und konsistent für ein gefaltetes Protein ist (Abbildung 4A). SHP2 besteht aus drei unabhängigen Domänen: zwei SH2-Domänen und der katalytischen Domäne (Abbildung 1). In der automatisch hemmenden geschlossenen Konformation werden diese Domänen selbst assoziiert; der schmelzübergang, der im thermischen Profilexp.......
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Diskussion
Wir haben einen Ziel-Engagement-Assay vorgestellt, der die direkte Bindung kleiner Moleküle an die SHP2-Phosphatase in Zellen bestätigen kann. Der Test kann zwischen niedrigen und hohen Affinitätshemmern unterscheiden und, was wichtig ist, einen Mangel an Wirksamkeit durch die allosterischen Inhibitoren des SHP099-Typs für die GOF onkogene SHP2-E76K Mutant bestätigen. Eine Stärke dieses miniaturisierten Assays ist seine Fähigkeit, in eine SHP2-Hemmer-Screening-Kampagne integriert zu werden. Die Fähigkeit des Assays, die .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (an L. T.), Epstein Family Foundation Award (an N. D. P.C.) und NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Darüber hinaus wurde dieses Projekt ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Chemical Biology Consortium Contract No finanziert. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Thermocycler mit 384-Bohrloch-Gradienten ausgestattet | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-Well-Mikroplatte mit niedrigem Totvolumen Echo-Qualifikation | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-Well-Zellkulturplatten | Greiner Bio-One | 657 160 | Steril mit Deckel |
| Antibiotikum-Antimykotikum (Anti-Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Zellzähler | Thermo Fisher Scientific | Gräfin II. FL | |
| Dulbeccos modifizierter Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo-akustischer Flüssigkeitsbehandler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Elektronische Mehrkanalpipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES-Puffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse Starterkit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Zu den Komponenten gehören EA-Puffer, Lysis-Puffer und Substrat |
| Mikroplatten-Leser | Tecan Trading AG | Spark | |
| Einkanal-Lösungstrog | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Natriumpyruvat | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermischer Mikroplattenversiegler | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfaktionsreagenzien | Polyplustransfektion | jetPRIME | |
| Trypan blau | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express Reagenz | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 Echtzeit-PCR-Platten | Eppendorf AG | 30132734 |
Referenzen
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
