Modelo de oclusão traqueal fetal transuterina em camundongos
Summary
Diversos modelos animais de hérnia diafragmática congênita e oclusão traqueal fetal apresentam vantagens e desvantagens em relação a questões éticas, custo, dificuldade cirúrgica, tamanho, taxas de sobrevivência e disponibilidade de ferramentas genéticas. Este modelo fornece uma nova ferramenta para estudar o impacto da oclusão traqueal e do aumento da pressão luminal no desenvolvimento pulmonar.
Abstract
A oclusão traqueal fetal (TO), modalidade de tratamento estabelecida, promove o crescimento pulmonar fetal e a sobrevivência em hérnia diafragmática congênita grave (CDH). Após to, a retenção do fluido epitelial secretado aumenta a pressão luminal e induz o crescimento pulmonar. Vários modelos animais foram definidos para entender a fisiopatologia do CDH e to. Todos têm suas próprias vantagens e desvantagens, como a dificuldade da técnica, o tamanho do animal, o custo, altas taxas de mortalidade e a disponibilidade de ferramentas genéticas. Aqui, um novo modelo transuterino de murine fetal TO é descrito. Camundongos gestantes foram anestesiados, e o útero exposto através de uma laparotomia midline. A traqueia dos fetos selecionados foi amarrada com uma única sutura transuterina colocada atrás da traqueia, uma artéria carótida e uma veia jugular. A barragem foi fechada e autorizada a se recuperar. Fetos foram coletados pouco antes da parturição. A relação peso pulmonar e corporal em TO fetos foi maior do que na relação controle dos fetos. Este modelo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para estudar o impacto tanto do TO quanto do aumento da pressão luminal no desenvolvimento pulmonar.
Introduction
A hérnia diafragmática congênita (CDH) ocorre em 1:2500 gestações e resulta em hipoplasia pulmonar e hipertensão pulmonar neonatal1,2,3,4,5,6. A oclusão traqueal fetal (TO) é uma terapia pré-natal estabelecida em pacientes graves de CDH envolvendo fetoscopia na 26-30ª semana gestacional em que um balão é colocado logo acima da carina e depois removido na 32ª semana gestacional. Este TO temporário induz o crescimento pulmonar fetal e melhora a sobrevivência. A Síndrome congênita da obstrução das vias aéreas altas é uma condição letal associada à hiperplasia pulmonar, que inspirou os cirurgiões a realizar a oclusão artificial da traqueia para promover a retenção do fluido epitelial secretado. Esta oclusão aumentou a pressão luminal e induziu o crescimento pulmonar7. No entanto, a oclusão deve ser revertida para permitir a maturação das células epiteliais.
Vários modelos animais de CDH e TO – ovino, coelho, rato e rato – foram desenvolvidos para entender a fisiopatologia do CDH e to. Todos têm suas próprias vantagens e desvantagens, como a dificuldade da técnica, o tamanho do animal, o custo, altas taxas de mortalidade e a disponibilidade de ferramentas genéticas. Embora a técnica cirúrgica utilizada para o modelo de ovino seja muito semelhante à usada em humanos e possa ser revertida, as principais desvantagens deste modelo são as despesas do animal, o longo período gestacional e o número limitado de cirurgias possíveis. O modelo coelho tem um período gestacional mais curto e é mais barato que o modelo de ovelhas. No entanto, o modelo coelho é irreversível8,9. O modelo murino tem o menor custo, o maior número de fetos por gravidez, o genoma mais caracterizado e ferramentas amplamente disponíveis para análises celulares e moleculares. No entanto, uma desvantagem fundamental é a falta de reversibilidade do TO, impedindo a compreensão completa do impacto do TO. Aqui, é apresentado um método que combina todas as vantagens dos modelos mencionados anteriormente e cria um modelo fácil, potencialmente reversível e minimamente invasivo de roedor TO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método descreve um procedimento cirúrgico de oclusão traqueal fetal em camundongos e seu impacto no desenvolvimento pulmonar. Existem algumas etapas críticas no protocolo que devem ser cuidadosamente realizadas para o sucesso da TO. O calor da plataforma em que a cirurgia ocorre e o soro fisiológico introduzido na cavidade peritoneal é crucial para a progressão da gravidez. Além disso, uma leve pressão deve ser aplicada na cabeça dos filhotes para garantir a exposição do pescoço.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa não recebeu nenhuma subvenção específica de agências de fomentamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos. Todos os autores fizeram contribuições substanciais para a concepção e elaboração do estudo, aquisição, análise e interpretação dos dados, elaboração do artigo e revisão para conteúdo intelectual importante e aprovação final da versão a ser submetida. Os autores agradecem a Can Sabuncuoğlu por seus esforços gentis na produção da obra de arte da técnica cirúrgica.
Materials
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
Referenzen
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