Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Viszerales Fettgewebe (VAT) ist ein aktives Stoffwechselorgan, das hauptsächlich aus reifen Adipozyten und stromalen Gefäßfraktionszellen (SVF) besteht, die verschiedene bioaktive Moleküle freisetzen, die Stoffwechsel-, Hormon- und Immunprozesse steuern. Derzeit ist unklar, wie diese Prozesse im Fettgewebe reguliert werden. Daher ist die Entwicklung von Methoden zur Bewertung des Beitrags jeder Zellpopulation zur Pathophysiologie des Fettgewebes von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierungsschritte und enthält die notwendigen Richtlinien zur Fehlerbehebung für die effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess unter Verwendung einer enzymatischen Kollagenase-Verdautechnik. Darüber hinaus ist das Protokoll auch für die Identifizierung von Makrophagen-Untergruppen und die Isolierung reifer Adipozyten-RNA für Genexpressionsstudien optimiert, was die Durchführung von Studien zur Analyse der Interaktion zwischen diesen Zellpopulationen ermöglicht. Kurz gesagt, VAT-Biopsien werden gewaschen, mechanisch zerkleinert und verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Nach der Zentrifugation werden reife Adipozyten durch Flotation aus dem SVF-Pellet isoliert. Das RNA-Extraktionsprotokoll gewährleistet eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA (einschließlich miRNAs) aus Adipozyten für nachgeschaltete Expressionsassays. Gleichzeitig werden SVF-Zellen verwendet, um Makrophagen-Untergruppen (pro- und antiinflammatorischer Phänotyp) durch Durchflusszytometrie-Analyse zu charakterisieren.

Einleitung

Weißes Fettgewebe besteht nicht nur aus Fettzellen oder Adipozyten, sondern auch aus einer fettfreien Zellfraktion, die als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bekannt ist und eine heterogene Zellpopulation enthält, die aus Makrophagen, anderen Immunzellen als regulatorische T-Zellen (Tregs) und Eosinophilen, Präadipozyten und Fibroblasten besteht, die von Gefäß- und Bindegewebe umgeben sind ^1,2. Fettgewebe (AT) gilt heute als Organ, das physiologische Prozesse im Zusammenhang mit Stoffwechsel und Entzündung durch Adipokine, Zytokine und microRNAs reguliert, die von verschiedenen Zellen produziert und in das Gew....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom IRB des Instituto Nacional de Perinatologia genehmigt (212250-3210-21002-06-15). Die Teilnahme war freiwillig, und alle eingeschriebenen Frauen unterschrieben die Einwilligungserklärung.

1. Entnahme von viszeralem Fettgewebe

1. Erhalten Sie VAT-Biopsien durch partielle Omentektomie während eines Kaiserschnitts von gesunden erwachsenen Frauen mit Einlingsschwangerschaften ohne Wehen.
2. Identifizieren Sie nach dem Uterusverschluss und der Blutstillung das Omentum major und verlängern Sie es auf einer feuchten Kompresse. Der exponierte AT ist die Mehrwertsteuer.
3. Suchen Sie das größte Blutgefä....

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine enzymatische Methode, bei der Kollagenase-Verdau gefolgt von einer differentiellen Zentrifugation verwendet wird, um in einem einzigen Prozess lebensfähige reife Adipozyten und SVF-Zellen aus VAT-Biopsien zu isolieren, die von gesunden schwangeren Frauen nach partieller Omentektomie gewonnen wurden. In diesem Fall verwenden wir die Adipozyten für die RNA-Extraktion und die SVF für die Makrophagen-Phänotypisierung.

Das RNA-Extraktionsprotokoll ermöglichte es, RN.......

Diskussion

VAT spielt eine entscheidende Rolle bei der Stoffwechselregulation und Entzündung. Das zunehmende Interesse an der Rolle von Adipozyten und Immunzellen bei der chronischen Entzündung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit hat zur Entwicklung verschiedener Techniken zur Trennung der in AT vorhandenen SVF- und Fettzellen geführt. Die meisten Techniken erlauben es jedoch nicht, diese beiden unterschiedlichen Zellgruppen, die für Downstream-Anwendungen geeignet sind, aus derselben VAT-Biopsie in einem einzigen Verfahren zu erhal.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 mL PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase frei und pyrogenfrei
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase frei und pyrogen
10 mL serologische Pipetten	Corning	CLS4101-50EA	Einzeln in Plastik verpackt
10 & Mikro; L universelle Pipettenspitze	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNasefrei und pyrogenfrei
10 & micro; L Universal-Pipettenspitze	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase-frei und pyrogenfrei
1000 & Mikro; L universelle Pipettenspitze	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase-frei und pyrogenfrei
2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNasefrei und pyrogenfrei
200 & Mikro; L Universal-Pipettenspitze	Axygen	T-200-Y-R	RNase-, DNase-frei und pyrogenfrei
2100 Bioanalysator Instrument	Agilent
G2939BA-2101 Bioanalysator PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software im PC vorinstalliert
5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden	Corning	352003	Schnappverschluss, steril
50 mL Zentrifugenröhrchen	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilen, konischer Boden und steriles
Reagenz auf Säure-Guanidinium-Phenol-Basis	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagenz oder ähnliches
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511-Agilent
Small RNA	Kit Agilent	5067-1548-APC
/Cy7 Anti-Human-CD14-Antikörper	BioLegend	325620	0,4 mg/106 Zellen, vorhanden auf Monozyten/Makrophagen, Klon HCD14
Baker	-	-	250 ml, unsteriles
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Hitzeschockfraktion, pH 5,2, ≥ 96%
Chip Priming	Station Agilent	5065-9951-Kollagenase
Typ II	Gibco	17101-015	Pulver
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Pulver
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Lieferung mit 50 mL TRI reagen
Präparierzange	-		Stahl, gezackte Backen und rund Enden
Sezierschale	-		Edelstahl
Ethylalkohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200  proof, für die Molekularbiologie
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences		342003-FACS
Lysing Solution	BD Biosciences
349202-FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences
648282-FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 vorinstalliertes
Hämazytometer	Sigma	Z359629-1EA	-
Manueller Zellzähler	-	-	-
Mayo-Präparierschere	-
Mikrozentrifuge		-	Einstellbare Temperatur
Nanotropfen-Spektralphotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP-Orbitalschüttler
	-		Einstellbare Temperatur und Geschwindigkeit
P10  variables Volumen  Mikropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 bis 10 μ; L
P1000  variables Volumen  Mikropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 bis 1000 μm L
P2  variables Volumen  Mikropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0,2 bis 2 μ; L
P200  variables Volumen  Mikropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 bis 200 μm L
PCR-Röhrchen-Aufbewahrungsgestell	Axygen
R96PCRFSP-PE/Cy5 Anti-Human-HLA-DR-Antikörper	BioLegend	307608	0,0625 mg/106Zellen, vorhanden auf Makrophagen, Klon L243
PE/Cy7 Anti-Human-CD45-Antikörper	BioLegend	304016	0,1 mg/106Zellen, vorhanden auf Leukozyten, Klon H130
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Pulver, pH 7,4, zur Herstellung von 1 l Lösungen
Pipettensteuerung	-	-	-
Lysepuffer für rote Blutkörperchen	Roche	11 814 389 001	Für die bevorzugte Lyse von roten Blutkörperchen aus menschlichem Vollblut
Gekühlte Zentrifuge	-	-	Mit Adapter für konische 50-ml-Röhrchen
Steriler Probenbehälter	-	-	-
Transferpipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Steriles
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0,4 % Lösung
Röhrchengestelle		-	Für verschiedene Röhrchengrößen
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	-

aus Edelstahl