אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש כדי לחקור ולמפה את התצהיר הממוקד של נשאי סמים לתאי אנדותל במודלים מפוברקים, בגודל אמיתי, עורק אנושי תלת מימדי תחת זרימה פיזיולוגית. השיטה המוצגת עשויה לשמש פלטפורמה חדשה למיקוד נשאי סמים בתוך מערכת כלי הדם.
Abstract
השימוש במודלים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) של עורקים אנושיים, המתוכננים עם הממדים והאנטומיה הנכונים, מאפשר מידול נכון של תהליכים חשובים שונים במערכת הלב וכלי הדם. לאחרונה, למרות מספר מחקרים ביולוגיים בוצעו באמצעות מודלים תלת ממדיים כאלה של עורקים אנושיים, הם לא הוחלו לחקור פילוח כלי דם. מאמר זה מציג שיטה חדשה לייצור מודלים עורקיים אנושיים בגודל אמיתי ומשוחזר באמצעות טכניקת הדפסה תלת-ממדית, ליישר אותם בתאי אנדותל אנושיים (ECs) וללמוד פילוח חלקיקים תחת זרימה פיזיולוגית. מודלים אלה יש את היתרון של שכפול הגודל הפיזיולוגי ואת התנאים של כלי הדם בגוף האדם באמצעות רכיבים בעלות נמוכה. טכניקה זו עשויה לשמש פלטפורמה חדשה ללימוד והבנת פילוח תרופות במערכת הלב וכלי הדם ועשויה לשפר את העיצוב של ננו-רפואה להזרקה חדשה. יתר על כן, הגישה המוצגת עשויה לספק כלים משמעותיים לחקר אספקה ממוקדת של סוכנים שונים למחלות לב וכלי דם תחת זרימה ספציפית למטופל ומצבים פיזיולוגיים.
Introduction
מספר גישות יושמו לאחרונה תוך שימוש בדגמים תלת-ממדיים של עורקים אנושיים1,2,3,4,5. מודלים אלה לשכפל את האנטומיה הפיזיולוגית ואת הסביבה של עורקים שונים בגוף האדם במבחנה. עם זאת, הם שימשו בעיקר במחקרי ביולוגיה של התא. מחקרים עדכניים על מיקוד כלי דם של חלקיקים לאנדותל כוללים סימולציות חישוביות סיליקו 6,7,8, במודלים מיקרופלואידיים במבחנה 9,10,11, ובדגמי בעלי חיים vivo 12. למרות התובנות שהם סיפקו, מודלים ניסיוניים אלה לא הצליחו לדמות במדויק את תהליך הפילוח המתרחש בעורקים האנושיים, שבו זרימת הדם והמודינמיקה מהווים גורמים דומיננטיים. לדוגמה, המחקר של מיקוד חלקיקים לאזורים טרשת עורקים בביפורציה בעורק הראשי, הידועים בדפוס זרימת ההדקלם המורכב שלהם ושיפוע מתח גזוז הקיר, עשוי להשפיע על המסע שנלקח על ידי החלקיקים לפני שהם מגיעים לאנדהל13,14,15,16. לכן, מחקרים אלה חייבים להתבצע בתנאים המשכפלים את הסביבה הפיזיולוגית, כלומר,גודל, ממד, אנטומיה ופרופיל זרימה.
לאחרונה, קבוצת מחקר זו מפוברק מודלים עורקיים אנושיים משוחזרים 3D כדי לחקור את התצהיר ואת מיקוד של חלקיקים vasculature17. המודלים התבססו על העתקים גיאומטריים תלת-ממדיים של כלי הדם האנושיים, אשר היו אז מתורבתים עם ECs אנושי כי לאחר מכן מרפד את הקירות הפנימיים שלהם. בנוסף, כאשר הם נתונים למערכת זלוף המייצרת זרימה פיזיולוגית, המודלים שיכפלו במדויק את התנאים הפיזיולוגיים. מערכת ההזנה תוכננה לחדיר נוזלים בקצב זרימה קבוע, תוך שימוש במשאבה פרייסטלית בתצורות סגורות ומעגלים פתוחים(איור 1). המערכת יכולה לשמש כמעגל סגור כדי למפות תצהיר חלקיקים ומיקוד לתאים שנזרעו בתוך מודל העורקנות. בנוסף, זה יכול לשמש מעגל פתוח לשטוף חלקיקים שאינם דבקים בסוף הניסויים כדי לנקות ולתחזק את המערכת. מאמר זה מציג פרוטוקולים לייצור דגמים תלת-ממדיים של ביפורציה דמוית-הלב האנושית, עיצוב מערכת ההזדוקות ומיפוי התצהיר של חלקיקים ממוקדים בתוך המודלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישות הנוכחיות לחקר פילוח כלי דם של חלקיקים נופלות בשכפול התנאים הפיזיולוגיים הקיימים בגוף האדם. מוצג כאן פרוטוקול לפברק מודלים משוחזרים תלת-ממדיים של עורקים אנושיים כדי לחקור את מיקוד החלקיקים ל- ECs המרפד את העורק תחת זרימה פיזיולוגית המיושמת באמצעות מערכת זלוף מותאמת אישית. בעת בחירת ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הישראלית למדע (מענק ISF # 902/18). המלגה של מריה חורי נתמכה על ידי תוכנית הדוקטורט לנשים של הברונית אריאן דה רוטשילד.
Materials
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID |
Referenzen
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions – American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
- Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
- Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
- Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
- Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
- Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
- Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
- Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
- Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
- Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
- Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).
