Summary

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

Published: September 07, 2021
doi:

Summary

Die vorliegende Studie berichtet über ein Protokoll für das Chromosomen-Screening menschlicher Embryonen, das verbrauchtes Kulturmedium verwendet, das eine Embryonenbiopsie vermeidet und die Identifizierung der Chromosomenploidie mittels NGS ermöglicht. Der vorliegende Artikel stellt das detaillierte Verfahren vor, einschließlich der Herstellung des Nährmediums, der Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), der Vorbereitung der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek (NGS) und der Datenanalyse.

Abstract

Bei der klinischen In-vitro-Fertilisation (IVF) erfordert die vorherrschende Methode für PGT-A die Biopsie einiger Zellen aus dem Trophektoderm (TE). Dies ist die Abstammungslinie, die die Plazenta bildet. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Fähigkeiten, ist invasiv und leidet unter falsch-positiven und negativen Ergebnissen, da die Chromosomenzahlen im TE und die innere Zellmasse (ICM), die sich zum Fötus entwickelt, nicht immer gleich sind. NICS, eine Technologie, die die Sequenzierung von DNA erfordert, die sowohl von TE als auch von ICM in das Nährmedium freigesetzt wird, könnte einen Ausweg aus diesen Problemen bieten, hat sich aber bisher als begrenzt wirksam erwiesen. Die vorliegende Studie berichtet über das vollständige NICS-Protokoll, das Methoden zur Probenahme von Nährmedien, zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) und zur Bibliotheksvorbereitung sowie zur NGS-Datenanalyse durch Analysesoftware umfasst. In Anbetracht der unterschiedlichen Kryokonservierungszeiten in verschiedenen Embryonenlabors stehen den Embryologen zwei Methoden zur Entnahme des Embryokulturmediums zur Verfügung, die je nach den tatsächlichen Bedingungen des IVF-Labors ausgewählt werden können.

Introduction

Assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs) werden zunehmend zur Behandlung von Unfruchtbarkeit eingesetzt. Die Erfolgsrate von ART, wie z. B. IVF, ist jedoch begrenzt, und die Rate der Fehlgeburten ist deutlich höher als die der Normalbevölkerung1. Die Hauptursache für diese Probleme sind Chromosomenanomalien, die häufig bei menschlichen Präimplantationsembryonen auftreten2. PGT-A ist eine wirksame Methode zum Screening von Embryonen auf Chromosomengleichgewicht vor der Implantation 3,4. Einige Studien haben bewiesen, dass PGT-A die Abtreibungsrate senken und die Schwangerschaftsrate verbessern kann 5,6,7,8. PGT-A erfordert jedoch komplexes technisches Fachwissen, das eine spezifische Ausbildung und Erfahrung erfordert. Die invasive Embryonenbiopsie kann auch zu einer Schädigung der Embryonen führen9. Studien haben gezeigt, dass die Blastomerbiopsie die spätere Entwicklung behindern kann und die Anzahl der biopsierten TEs die Implantationsraten beeinflussen kann10. Obwohl das Problem der langfristigen biologischen Sicherheit der Embryonenbiopsie beim Menschen noch nicht gründlich untersucht wurde, haben Tierstudien gezeigt, dass sie negative Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung hat11,12,13.

Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass während der Embryonalentwicklung Spuren von DNA-Material in das Kulturmedium abgesondert wurden, und es wurden Anstrengungen unternommen, ein umfassendes Chromosomen-Screening (CCS) mit verbrauchtem Embryokulturmedium durchzuführen 14,15,16,17,18. Die Nachweisraten und die Genauigkeit der Tests haben jedoch nicht die Anforderungen für einen umfassenden klinischen Einsatz erfüllt. Die vorliegende Studie berichtete über eine Verbesserung des NICS-Assays zur Erhöhung der Detektionsraten sowie der Genauigkeit des NICS-Tests19. In den letzten Jahren wurde Blastocoele-Flüssigkeit (BF) als analytische Probe der minimalinvasiven PGT-A untersucht. Der Anteil der erfolgreichen genomweiten Amplifikation und der nachweisbaren DNA in Blastozystenflüssigkeitsproben liegt jedoch zwischen 34,8 % und 82 %20,21,22. Das in verschiedenen Studien berichtete BF-Volumen reicht von 0,3 nL bis 1 μL. Angesichts der geringen Menge an DNA in BF ist es möglich, die Menge an zellfreier DNA durch Mischen von Blastozystenflüssigkeit und Kulturmedium zu erhöhen, um die Erfolgsrate und Konsistenz des Nachweises zu verbessern. Kuznyetsov et al.23 und Li et al.24 behandelten die Zona pellucida mit einem Laser und setzten Blastozystenflüssigkeit in das Kulturmedium frei, um die Gesamtmenge der embryonalen DNA zu verbessern, und die Amplifikationsrate der kombinierten Medium/BF-Proben nach WGA betrug 100 % bzw. 97,5 %. Jiao et al.25 erhielten mit der gleichen Methode ebenfalls eine 100%ige Amplifikationserfolgsrate.

Die vorliegende Studie berichtet über ein detailliertes Protokoll, das die Probenvorbereitung für verbrauchte Medien, die NGS-Vorbereitung und die Datenanalyse umfasst. Durch die sorgfältige Entfernung von Kumuluszellen aus den Eizellen wurden in der vorliegenden Studie intrazytoplasmatische Einzelspermieninjektionen (ICSI) und Blastozystenkulturen durchgeführt. Das verbrauchte Medium an Tag 4 Tag 5/Tag 6 wurde für die Vorbereitung der WGA- und NGS-Bibliothek gesammelt. Durch den Einsatz der NICS-Technologie konnte die vorliegende Studie die Vorbereitungsschritte der WGA- und NGS-Bibliothek in ca. 3 h rationalisieren und die nicht-invasiven CCS-Ergebnisse in ca. 9 h erhalten.

Protocol

Die ethische Erlaubnis wurde von der Ethikkommission des Dritten Krankenhauses der Universität Peking eingeholt. 1. Vorbereitung HINWEIS: Die erforderlichen Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Reagenzien20-30 μl Gametenmedium/Befruchtungsmedium und Spalt-/Blastozystenstadium Kulturmedium (mit Mineralöl bedeckt) und Hyaluronidase (in einem dicht verschlossenen Röhrchen) bei 37 °C, 5 % CO2 und …

Representative Results

In der vorliegenden Studie wurde die vorgeschlagene Methode auf einen Patienten angewendet. Die IRB-Genehmigung und die Einwilligung nach Aufklärung wurden vor der Anwendung der NICS-Analyse eingeholt. In der vorliegenden Studie wurden 6 Blastozysten von Patientinnen entnommen und NICS an allen 6 Embryonen an Tag 4 bis Tag 5 durchgeführt. Chromosomenanomalien, die durch die balancierte Translokation der Eltern verursacht wurden, wurden in fünf Chromosomen mit dem NICS-Assay nachgewiesen; daher konnten sie nicht für d…

Discussion

Modifikationen und Fehlerbehebung

Wenn die NICS-Ergebnisse mit elterlichem genetischen Material verunreinigt sind, stellen Sie sicher, dass alle Cumulus-Corona-Radiata-Zellen entfernt werden und stellen Sie sicher, dass eine ICSI zur Befruchtung durchgeführt wird. Unsachgemäße Medienlagerung oder Template-Vorbereitungsprozesse werden vermieden, die die DNA abbauen können. Der Arbeitsraum wurde gründlich mit DNase- und RNase-Dekontaminationsreagenzien gereinigt. Um eine Ko…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Shiping Bo und Shujie Ma für ihre Unterstützung bei der NGS-Datenanalyse. Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch das National Key Research and Development Program unterstützt (Grant No. 2018YFC1003100).

Materials

1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

Referenzen

  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
  10. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medizin. 94 (12), e669 (2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
  29. . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

View Video