Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

HIV-1 verursacht eine chronische Infektion, von der weltweit mehr als 37 Millionen Menschen betroffen sind. Menschen, die mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) leben, erleben trotz antiretroviraler Therapie eine Komorbidität im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen. Diese entzündlichen Signale wurden jedoch nicht vollständig charakterisiert. Die Rolle von Früheintrittsereignissen bei der Aktivierung zellulärer Signalereignisse und der nachgelagerten Genexpression wurde auf Einzelzellebene nicht erfasst. Hier beschreiben die Autoren eine Methode, die Prinzipien der Lebendzellfluoreszenzmikroskopie auf eine automatisierte Einzelzellplattform anwendet, die Zellen über benutzerspezifische Zeitkurse kulturiert und abbildet, was eine Hochdurchsatzanalyse dynamischer zellulärer Prozesse ermöglicht. Dieser Assay kann die einzellige Live-Fluoreszenzmikroskopie von frühen Ereignissen verfolgen, die unmittelbar auf eine HIV-1-Infektion folgen, insbesondere den Zustrom von Kalzium, der mit der Exposition gegenüber dem Virus einhergeht, und die Entwicklung einer produktiven Infektion mit einem fluoreszierenden Reportervirus. MT-4-Zellen werden mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen und in isolierten Pens auf einem nanofluidischen Gerät kultiviert. Die kultivierten Zellen sind mit einem HIV-1-Reportervirus (HIV-1 NLCI) infiziert. Ein Fluoreszenzmikroskop, das über dem nanofluidischen Gerät positioniert ist, misst den Kalziumzustrom über einen Zeitraum von 8 Minuten nach akuter HIV-1-Exposition. Die HIV-1-produktive Infektion wird in denselben Zellen über ein 4-Tage-Intervall gemessen. Bildgebende Daten aus diesen Zeitverläufen werden analysiert, um Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik zu definieren. Die Autoren präsentieren eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung zu ermöglichen. Dieser Assay kann die Kinetik von Ereignissen unter verschiedenen Bedingungen messen, einschließlich Zelltyp, Agonist oder Antagonisteneffekt, während er eine Reihe von Parametern misst. Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung: Diese Technik kann breit angepasst werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einleitung

Chronische Entzündungen sind eine der Hauptursachen für HIV-assoziierte frühe Morbiditäten und Mortalität^1,2,3. Es gibt mehrere Mechanismen, durch die HIV entzündliche Signale aktivieren kann, und neuere Beweise deuten auf eine Rolle für die P2X-Rezeptoren beim HIV-Eintritt hin, die Calcium-gating Adenosintriphosphat (ATP)^-Rezeptorensind 3^{,4,5,6,7,8,9<....}

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

1. Bereiten Sie eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor: Fügen Sie 25 μL 100x konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel hinzu und fügen Sie dann 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x in ein 1,5 ml Röhrchen hinzu. Wirbel zum Mischen.
2. 2,5 ml Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Vor Licht schützen.
3. Zentrifuge 2 x 10⁶ MT-4 Zellen bei 500 x g für 3 min.
4. Entfernen Sie das Medium und entfernen Sie das Pellet in 2 ml der vorbereiteten Fluo-4 AM-Ladelösung. Vor Licht schützen.
5. Pipette resuspendierte Zellen in eine 35 mm Petrischale. Bei 37 °C 15-30 m....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Format des Chips und die mit dem Fluoreszenzmikroskop erfassten Rohdaten. Die Identifizierung und Clusterung von nicht infizierten und infizierten Zellen mittels mCherry-Messung ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Cluster werden in Abbildung 3auf Kalziumzuflusskinetik analysiert, die einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigt. Abbildung 4 zeigt eine signifikante .......

Diskussion

Die beschriebene Methodik zur Untersuchung der Beziehung zwischen Kalziumzustrom und HIV-1-produktiver Infektion in einzelnen Zellen kann angepasst werden, um die intrazelluläre Kalziumkinetik als Reaktion auf andere Agonisten oder Antagonisten von Interesse zu untersuchen. Die Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung ist einfach, minimal zeitintensiv und Reagenzien sind in praktischen Kits von weit verbreiteten Herstellern erhältlich. Die Calciummessung auf Fluo-4-Basis ist in der Literatur gut beschrieben, und HIV-1 .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Leuchtfeuer Optofluidisches System	Berkeley Leuchten
Fötales Rinderserum	Gibco
Fidschi	Open-Source-Software	PMID: 22743772, 22930834
Fluo-4 Calcium Imaging Kit	Thermo Fisher	F10489
HIV-1 NLCINL4-3	Labor von Benjamin Chen	PMID: 28148796
Hyclone Pennecillin Streptomycin-Lösung	GE Healthcare Life Sciences	SV30010
MT-4-Zellen	NIH AIDS Reagenz		ARP-120
OptoSelect 3500 Chip	Berkeley Leuchten
Pipettierspitzen	Denville Scientific	P3020-CPS
Prism 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldbsp	; R8758
Serologische Pipetten	der Marke Fisher	nbsp; 13-678-11E
Gewebekulturhaube	Verschiedene Modelle
T75 Kolben	Corning	3073

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