כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.
שלל חוץ-תאי (EVs) משמשים במחקרים שונים כדי להוכיח את הפוטנציאל שלהם כטיפול ללא תאים בשל המטען שלהם נגזר מהמקור הסלולרי שלהם, כגון טסיות דם ליסאט (PL). כאשר נעשה שימוש כטיפול, EVs צפויים להיכנס לתאי היעד ולחולל תגובה מאלה. במחקר זה, EVs שמקורו PL נחקרו כטיפול ללא תאים עבור דלקת מפרקים ניוונית (OA). לכן, נקבעה שיטה לסימון רכבים דרכים אלקטרוניים ולבחון את ספיגתם על מגרשי סחוס. כלי עבודה חשמליים שמקורם ב-PL מסומנים בצבע ליפופילי PKH26, נשטפים פעמיים דרך עמוד, ולאחר מכן נבדקים במודל OA מונע דלקת במבחנה למשך 5 שעות לאחר כימות חלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA). לפי שעה, explants סחוס קבועים, paraffined, לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר לעלות על שקופיות, ונצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הדבר מאפשר אימות אם EVs להזין את תאי היעד (chondrocytes) במהלך תקופה זו ולנתח את ההשפעה הישירה שלהם.
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה ניוונית מפרקית המרמזת על דלקת מתקדמת ובלתי הפיכה והרס של המטריצה החוץ תאית של הסחוס המפרקי1. למרות צורות שונות של דלקת פרקים יש טיפולים רבים2,3,4, אלה מוגבלים על ידי תופעות הלוואי שלהם ויעילות מוגבלת. טכניקות הנדסת רקמות באמצעות השתלת כונדרוציטים אוטולוגית מיושמות באופן שגרתי לטיפול רגנרטיבי של סחוס פצוע בפצעים סחוס מוקדם OA4. טיפולים מבוססי תאים מוגבלים בעיקר בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים יציבים פנוטיפיקית או chondroprogenitors המסוגלים לתקן ביעילות את הסחוס3. לכן, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות למניעת התקדמות המחלה וחידוש נגעים סחוס גדולים הוא בעל חשיבות עליונה.
שלל חוץ תאי (EVs) הוצעו כטיפול OA על ידי מחברים שונים5,6. רכבים יפים הם גופים membranous המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, מעורבים איתות בין תאי, הוכחו להפעיל את ההשפעות הטיפוליות של תאי גזע7,8,9, שבגללם הם עוררו לאחרונה עניין ברפואה רגנרטיבית10. EVs נגזר תאים סטרומיים mesenchymal (MSCs) הם EVs הטיפולי העיקרי נחקר עבור OA, אם כי תאים אחרים הקשורים למפרקים שימשו כמקורות EV, למשל, chondroprogenitors או תאים חיסוניים11,12.
תרכיזי טסיות דם, כגון טסיות דם (PLs), משמשים כדי לשפר את ריפוי הפצע בפציעות שונות, כגון כיבים קרנית13,14,15 או התחדשות רקמתגיד 16, בגלל ההשערה כי רכיב EV של תרכיזי טסיות דם עשוי להיות אחראי על תופעות אלה17 . מחקרים מסוימים הקשורים למחלות הקשורות למפרקים משתמשים בטסיות דם אלקטרוניות (PL-EVs) כטיפול כדי לשפר מצבים אוסטיאוארטיטיקה. PL-EVs לשפר את התפשטות chondrocyte ונדידת תאים על ידי הפעלת Wnt / β-catenin מסלול18, קידום הביטוי של סמנים chondrogenic בכונדרוציטים osteoarthritic19, או מראה רמות גבוהות יותר של חלבונים כונדרוגניים ופחות חריגות tissular בארנבות osteoarthritic שטופלו PL-EVs18.
רכבים אופניים מכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין המשוחררים לתא היעד, ומבססים תקשורת בין תאים, שהיא התכונה העיקרית הקשורה ליישומים הטיפוליים שלהם20. ההשפעות של רכבים הפעלה אלקטרוניים תלויות בתאים המגיעים אליהם ובשחרור המטען הבא. השפעה זו יכולה להיות מאושרת בעקיפין על ידי שינויים הנגרמים בתאים, כגון פעילות מטבולית או שינוי ביטוי גנים. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות הדמיה של האופן שבו EVs להגיע לתאים כדי להפעיל את הפונקציה שלהם. לכן, מאמר זה מציג שיטה לתייג את אלה PL נגזר רכבים רחפנים לשמש כטיפול עבור דלקת מונע סחוס explants. מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה לניטור ספיגת EV והתקדמות chondrocytes הנוכחי explants ב- time-lapse של 5 שעות.
הדמיית EV מסייעת להבין תכונות EV, כגון מנגנוני השחרור והספיגה שלהם. ההדמיה שלהם מאפשרת ניטור של ההבחנה הביולוגית שלהם ואת אפיון המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם ככלי רכב תרופתיים. עם זאת, דימות EV ומעקב עשוי להיות קשה בשל הגדלים הקטנים שלהם, אם כי מכשירי הדמיה רבים וטכניקות תיוג פותחו כדי לעזור ל…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי המכון לסאלוד קרלוס השלישי, שר הכלכלה y Competitividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן לפיתוח אזורי אירופי ERDF (MS16/00124; CP16/00124); על ידי PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, לפרש SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), ממומן על ידי מס תיירות בת קיימא של האיים הבלאריים; על ידי Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); על ידי תוכנית הפוסט-דוקטורט FOLIUM (FOLIUM 17/01) בתוך FUTURMed, ממומנת ב -50% על ידי מס התיירות בת קיימא של האיים הבלאריים וב -50% על ידי ESF; and by the Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Material | |||
1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
Equipment | |||
Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |