一种用于果蝇嗅觉回路组装延时成像研究的外植体系统
Summary
该协议描述了用于研究嗅路组装的触角脑外植体系统的解剖程序，培养条件和现场成像。
Abstract
~神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为来自触角和上颌触缘的50种类型的嗅觉受体神经元（ORN）将其轴突投射到触角叶中的50个可识别的肾小球，并与来自50种类型的二阶投射神经元（PNs）的树突形成突触连接。以前的研究主要集中在识别使用固定组织调节嗅觉回路中精确靶向的重要分子。在这里，描述了一种触角 – 脑外植体系统，该系统概括了培养物中嗅觉回路组装的关键发育里程碑。通过解剖外部角质层并清洁覆盖发育中的蛹脑的不透明脂肪体，可以使用双光子显微镜收集来自活脑的单个神经元的高质量图像。这允许对来自活组织的单个ORN轴突靶向进行延时成像。这种方法将有助于揭示先前确定的重要基因的重要细胞生物学背景和功能，并确定支撑电路组装动态过程的机制。
Introduction
神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。100多年来，神经科学家一直试图以极高的精度了解神经突起如何向中间和最终目标延伸。因此，他们已经确定了编码神经元过程1的引导线索的重要基因。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为嗅觉受体神经元（ORN，初级感觉神经元）投射到50个具有典型大小，形状和相对位置的可识别肾小球，其中它们与来自50种类型的二阶投影神经元（PNs）的树突形成突触连接，每个树突将树突发送到50个肾小球2 中的一个（图1A).因此，在苍蝇嗅觉系统中以突触（肾小球）分辨率鉴定突变表型相对容易。这导致了调节嗅觉回路组装的重要基因的发现3。
苍蝇嗅觉回路的组装依赖于时间和空间协调的发展过程3.ORN和PN获得不同的细胞命运，这为其布线特异性设置了程序。接下来，PN树突预涂了触角叶（图1B）。然后，ORN的轴突环绕同侧触角叶并穿过大脑的中线到达对侧触角叶。随后，ORN轴突侵入ipsi和对侧触角叶，并在特定肾小球中与其伴侣PN的树突形成突触。该嗅觉电路组装的粗略模型是基于在开发过程中从中间时间点表征固定样品而提出的。时间分辨率差，无法从固定组织发育过程中遵循相同的神经元过程，这限制了对电路组装过程的机制理解。
在体内实时成像ORN和PN过程在技术上具有挑战性，因为布线过程发生在蛹阶段的前半部分，当触角叶被蛹壳内不透明的脂肪体包围时。因此，不可能从完整的蛹直接成像发育中的嗅觉回路。离体培养的解剖组织可以规避组织混浊度，并已成功用于研究神经发育4，5，6。使用类似的离体外植体培养策略来研究蛹脑中的神经元布线的挑战在于它是否概括了培养条件下精确的神经元靶向。根据先前报道的苍蝇眼脑复合物7的离体培养条件，最近开发了一种包含整个蛹脑，触角和连接触角神经完整的外植体，其保留了嗅觉回路的精确靶向，并且可以以每20分钟的频率进行基于双光子显微镜的实时成像长达24小时8.在这里，描述了外植体培养和成像的详细方案。外植体系统为研究嗅觉回路和中枢大脑中潜在其他回路的组装提供了一种强大的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
果蝇触角-脑外植体保持嗅觉回路的正常靶向。我们确实注意到，与体内相比，离体发育慢2倍。值得注意的是，外植体系统不保留上颌触诊，上颌触诊具有六种类型的ORN。为确保体外恢复正常发育，在外植体解剖期间需要避免触角神经的拉伸。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅路发育停滞。因此，在成像之前对培养皿和针进行彻底灭菌并保持成像室的清?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢N. Özel和R. Hiesinger对外植体文化的建议;M. Wagner为双光子显微镜提供技术帮助;D.J. Luginbuhl用于产生转基因苍蝇;D. 弗里德曼对斐济软件分析提出建议;Y. Ge协助飞行工作;C. McLaughlin和K.K.L. Wong对手稿的评论。L.L.是霍华德休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款1K99DC01883001（到T.L.）和R01-DC005982（到L.L.）的支持。
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referenzen
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