Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. Dieses Papier hebt NTA-experimentelle Parameter und Kontrollen sowie eine einheitliche Methode zur Analyse und Charakterisierung von Proben und Verdünnungsmitteln hervor, die notwendig ist, um die von MISEV2018 und EV-TRACK vorgeschlagenen Richtlinien für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zu ergänzen.
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Methodenartikel
Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist seit 2006 eine von mehreren Charakterisierungsmethoden, die für die extrazelluläre Vesikelforschung (EV) eingesetzt werden. Viele sind der Meinung, dass NTA-Instrumente und ihre Softwarepakete nach minimaler Schulung leicht verwendet werden können und dass die Größenkalibrierung intern möglich ist. Da sowohl die NTA-Akquisition als auch die Softwareanalyse eine EV-Charakterisierung darstellen, werden sie in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018) behandelt. Darüber hinaus wurden sie durch Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) überwacht, um die Robustheit von EV-Experimenten zu verbessern (z. B. Minimierung der experimentellen Variation aufgrund unkontrollierter Faktoren).
Trotz der Bemühungen, die Berichterstattung über Methoden und Kontrollen zu fördern, berichten viele veröffentlichte Forschungsarbeiten nicht über kritische Einstellungen, die zur Reproduktion der ursprünglichen NTA-Beobachtungen erforderlich sind. Nur wenige Artikel berichten über die NTA-Charakterisierung von Negativkontrollen oder Verdünnungsmitteln, wobei offensichtlich davon ausgegangen wird, dass kommerziell erhältliche Produkte, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder ultrareines destilliertes Wasser, frei von Partikeln sind. In ähnlicher Weise werden Positivkontrollen oder Größenstandards selten von Forschern berichtet, um die Partikelgröße zu überprüfen. Die Stokes-Einstein-Gleichung enthält Probenviskositäts- und Temperaturvariablen, um die Partikelverschiebung zu bestimmen. Die Meldung der stabilen Laserkammertemperatur während der gesamten Probenvideoentnahme ist daher eine wesentliche Kontrollmaßnahme für eine genaue Replikation. Die Filtration von Proben oder Verdünnungsmitteln wird ebenfalls nicht routinemäßig gemeldet, und wenn ja, werden die Besonderheiten des Filters (Hersteller, Membranmaterial, Porengröße) und Lagerbedingungen selten berücksichtigt. Die Mindeststandards der International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) für akzeptable experimentelle Details sollten ein gut dokumentiertes NTA-Protokoll für die Charakterisierung von EVs enthalten. Das folgende Experiment liefert den Nachweis, dass ein NTA-Analyseprotokoll vom einzelnen Forscher erstellt und in die Methoden von Publikationen einbezogen werden muss, die die NTA-Charakterisierung als eine der Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Anforderungen für die Charakterisierung einzelner Vesikel verwenden.
Einleitung
Die genaue und wiederholbare Analyse von Elektrofahrzeugen und anderen nanometerskaligen Partikeln stellt Forschung und Industrie vor zahlreiche Herausforderungen. Die Replikation der EV-Forschung war schwierig, zum Teil aufgrund der mangelnden Einheitlichkeit bei der Berichterstattung über die notwendigen Parameter im Zusammenhang mit der Datenerhebung. Um diese Mängel zu beheben, schlug das ISEV Industrierichtlinien als minimale Reihe von biochemischen, biophysikalischen und funktionellen Standards für EV-Forscher vor und veröffentlichte sie als Positionspapier, das allgemein als MISEV20141 bezeichnet wird. Das beschleunigte Tempo der EV-Fors....
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Protokoll
1. Allgemeine Protokollrichtlinien
- Halten Sie das Mikroskop auf einem Lufttisch oder mindestens auf einem vibrationsfreien Tisch. Stellen Sie sicher, dass Fremdvibrationen (z. B. Fußklopfen auf den Boden, Berühren des Tisches, Türschließungen, Laborverkehr) auf ein Minimum reduziert werden.
- Stellen und halten Sie die Temperatur des Lasermoduls für alle Videoaufnahmen auf einer konstanten Temperatur.
HINWEIS: Die gewählte Temperatur betrug 25 °C, da der Nanopartikelgrößenanalysator auf diese Temperatur kalibriert wurde. Daher ist es wichtig, dass alle Benutzer des Instruments die kalibrierte Temperatur kennen und verwenden. Die R....
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Ergebnisse
Tabelle 1 enthält die Ergebnisse der NTA-Videos für die Liposomenproben (18 gefiltert und 18 ungefiltert) und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel. Vergleiche zwischen den beiden Gruppen wurden unabhängig von der Kamerastufe oder dem Erkennungsschwellenwert in diesem Dokument durchgeführt. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108,5 nm, einen Partikelmodus von 86,2 nm und eine Konzentration von 7,4 × 108 Partikeln /ml. Im Gegensatz dazu hatten ungefilterte Prob.......
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Diskussion
Es gibt mehrere Methoden, um die Größe und Konzentration von Nanopartikelnabzuschätzen 11. Dazu gehören Ensemble-Methoden, die eine Größenschätzung aus einer Population generieren, einschließlich dynamischer Lichtstreuung (DLS), zentrifugaler Sedimentation und Einzelpartikel-Level-Analyse - Elektronenmikroskopie, NTA, Rasterkraftmikroskopie und abstimmbarer resistiver Pulsmessung. Von diesen sind DLS und NTA weit verbreitete, zerstörungsfreie Größen- und Konzentrationsmessmethoden, die auf der Bro.......
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Offenlegungen
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Arbeit wurde vom Bundesstaat Kansas zum Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), vom Johnson Cancer Research Center zum MLW und vom NIH R21AG066488 zum LKC unterstützt. OLS erhielt GRA-Unterstützung vom MICSCB. Die Autoren danken Dr. Santosh Aryal für die Bereitstellung der in diesem Projekt verwendeten Liposomen und den Mitgliedern der Weiss- und Christenson-Labors für hilfreiche Gespräche und Feedback. Dr. Hong He wird für die technische Unterstützung gedankt. MLW dankt Betti Goren Weiss für ihre Unterstützung und ihren Rat.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| , konisch, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Linsenreiniger | |||
| Linsenpapier | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Lasermodul | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Papierhandtücher | |||
| Pipettenspitzen, 1-200 & Mikro; L, gefiltert, steril, niedrig bindend | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipettenspitzen, 50-1.000 & Mikro; L, gefiltert, steril | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Kochsalzlösung, Dulbecco-Phosphat gepuffert (ohne Ca oder Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latextransfer - 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latextransfer - 50 nm (3 ml) | Malvern | NTA4087 | |
| Spritzenvorsatzfilter, 33 mm, .22 & micro; m, MCE, steril | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Spritze, TB, 1 mL, Aufsteckspitze | Becton Dickinson | 309659 | |
| Abfallbehälter |
Referenzen
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
