Évaluation physiopathologique rétinienne dans un modèle de rat
Summary
La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.
Abstract
Une maladie oculaire du segment postérieur comme la rétinopathie diabétique modifie la physiologie de la rétine. La rétinopathie diabétique se caractérise par un décollement de la rétine, une rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) et une angiogenèse rétinienne. Un modèle de rat in vivo est un outil expérimental précieux pour examiner les changements dans la structure et la fonction de la rétine. Nous proposons trois techniques expérimentales différentes dans le modèle du rat pour identifier les changements morphologiques des cellules rétiniennes, du système vasculaire rétinien et de la BRB compromise. L’histologie rétinienne est utilisée pour étudier la morphologie de diverses cellules rétiniennes. En outre, la mesure quantitative est effectuée par le nombre de cellules rétiniennes et la mesure de l’épaisseur de différentes couches rétiniennes. Un test de dégradation BRB est utilisé pour déterminer la fuite de protéines extraoculaires du plasma vers le tissu vitré en raison de la dégradation de BRB. L’angiographie par fluorescence est utilisée pour étudier l’angiogenèse et les fuites des vaisseaux sanguins en visualisant le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran.
Introduction
La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications secondaires les plus complexes du diabète sucré. C’est aussi la principale cause de cécité évitable dans la population en âge de travailler dans le monde. Dans une méta-analyse récente portant sur 32,4 millions de personnes aveugles, 830 000 (2,6%) personnes étaient aveugles en raison de DR1. La proportion de perte de vision attribuée au diabète se classait au septième rang en 2015 à 1,06% (0,15-2,38) dans le monde2,3.
La rétinopathie diabétique est diagnostiquée par des anomalies vasculaires dans les tissus oculaires postérieurs. Cliniquement, il est divisé en deux étapes – DR non proliférative (NPDR) et DR proliférative (PDR), en fonction de la vascularisation de la rétine. L’hyperglycémie est considérée comme le puissant régulateur de la RD car elle implique plusieurs voies impliquées dans la neurodégénérescence4,5, l’inflammation6,7 et la microvascularisation8 dans la rétine. Les multiples complications métaboliques induites par l’hyperglycémie comprennent l’accumulation de produits finaux de glycation avancée (AGE), de la voie polyol, de la voie hexosamine et de la voie protéine kinase-C. Ces voies sont responsables de la prolifération cellulaire (cellules endothéliales), de la migration (péricytes) et de l’apoptose (cellules rétiniennes neurales, péricytes et cellules endothéliales) en fonction des différents stades de la rétinopathie diabétique. Ces altérations métaboliques peuvent entraîner des changements physiologiques tels que le décollement de la rétine, la perte de cellules rétiniennes, la dégradation de la barrière hémato-rétinienne (BRB), les anévrismes et l’angiogenèse9.
Le diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) est une pratique bien établie et bien acceptée chez le rat pour évaluer la pathogenèse du diabète et ses complications. Les effets diabétogènes de STZ sont dus à la destruction sélective des îlots pancréatiques β-cellules10. En conséquence, les animaux subiront une carence en insuline, une hyperglycémie, une polydipsie et une polyurie, qui sont toutes caractéristiques du diabète sucré de type 1 humain11. Pour l’induction sévère du diabète, STZ est administré à 40-65 mg / kg de poids corporel par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à l’âge adulte. Après environ 72 h, ces animaux présentent une glycémie supérieure à 250 mg/dL10,12.
Pour comprendre les altérations physiologiques de la rétine dues à la neurodégénérescence, à l’inflammation et à l’angiogenèse, différentes techniques doivent être optimisées dans des modèles animaux expérimentaux. Les changements structurels et fonctionnels dans les cellules rétiniennes et les vaisseaux rétiniens peuvent être étudiés par diverses techniques telles que l’histologie, le test de dégradation BRB et l’angiographie par fluorescence.
L’histologie implique l’étude de l’anatomie des cellules, des tissus et des organes à un niveau microscopique. Il établit une corrélation entre la structure et la fonction des cellules/tissus. Plusieurs étapes sont effectuées pour visualiser et identifier les altérations microscopiques de la structure tissulaire, comparant ainsi les homologues sains et malades13. Par conséquent, il est essentiel de normaliser méticuleusement chaque étape de l’histologie. Diverses étapes de l’histologie rétinienne sont la fixation de l’échantillon, la coupe de l’échantillon, la déshydratation, le nettoyage, l’imprégnation avec de la paraffine, l’incorporation de paraffine, le sectionnement et la coloration (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine)13,14.
Dans une rétine saine, le transport des molécules à travers la rétine est contrôlé par BRB, composé de cellules endothéliales et de péricytes sur la face interne, et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sur la face externe. Cependant, les cellules endothéliales internes du BRB et les péricytes commencent à dégénérer pendant la maladie, et le BRB est également compromis15. En raison de cette dégradation de la BRB, de nombreuses molécules de faible poids moléculaire s’infiltrent dans le tissu vitré et rétinien16. Au fur et à mesure que la maladie progresse, de nombreuses autres molécules protéiques (poids moléculaire faible et élevé) s’infiltrent également dans les tissus vitrés et rétiniens en raison de troubles de l’homéostasie17. Il conduit à diverses autres complications et finalement à l’œdème maculaire et à la cécité. Par conséquent, la quantification des niveaux de protéines dans le vitré et la comparaison des états sains et diabétiques ont compromis la BRB.
L’angiographie par fluorescence est une technique utilisée pour étudier la circulation sanguine de la rétine et de la choroïde à l’aide d’un colorant fluorescent. Il est utilisé pour visualiser le système vasculaire de la rétine et de la choroïde en injectant du colorant fluorescéine par voie intraveineuse ou par injection cardiaque18. Une fois le colorant injecté, il atteint d’abord les artères rétiniennes, suivies des veines rétiniennes. Cette circulation du colorant est généralement terminée dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection du colorant19. C’est une technique importante pour diagnostiquer diverses maladies oculaires du segment postérieur, y compris la rétinopathie diabétique et la néovascularisation choroïdienne20. Il aide à détecter les changements vasculaires majeurs et mineurs dans les conditions normales et malades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologie
L’histologie rétinienne est réalisée pour visualiser les changements morphologiques des cellules et des couches rétiniennes. Diverses étapes, y compris le choix de la solution fixative, la durée de fixation, la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, doivent être optimisées. La taille des tissus ne doit pas dépasser 3 mm, car la pénétration du fixateur devient lente. Le paraformaldéhyde à 4% couramment utilisé conduit à un décollement de la rétine même dans…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Conseil indien de la recherche médicale (ICMR; ITR-2020-2882) pour le soutien financier au Dr Nirmal J. Nous tenons également à remercier la subvention de la Commission de l’Université pour avoir fourni une bourse de recherche junior à Manisha Malani et le Laboratoire central d’analyse, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad pour avoir fourni des infrastructures.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Referenzen
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