Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü
Summary
Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.
Abstract
Postimplantasyon memeli embriyo kültürü yöntemleri genellikle verimsiz ve rahim dışı diseksiyon sonrası kısa sürelerle sınırlı olmuştur. Platformlar son zamanlarda yumurta silindir aşamalarından ileri organogenez kadar fare embriyolarının son derece sağlam ve uzun süreli ex utero kültürü için geliştirilmiştir. Bu platformlar, öngaztasyon embriyolarının (E5.5) arka ekstremite oluşum aşamasına (E11) kadar uygun ve sadık gelişimini sağlar. Geç gastrulating embriyoları (E7.5) bu ortamlarda dönen şişelerde yetiştirilirken, pregastrülasyon aşamalarından (E5.5 veya E6.5) genişletilmiş kültür statik ve dönen şişe kültürlerinin bir kombinasyonunu gerektirir. Ek olarak, O2 ve CO2 konsantrasyonunun hassas düzenlenmesi, gaz basıncı, glikoz seviyeleri ve belirli bir ex utero kültür ortamının kullanımı uygun embriyo gelişimi için kritik öneme sahiptir. Burada, genişletilmiş ex utero fare embriyo kültürü için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Normal fare embriyolarının gastrülasyondan organogeneze kadar ekstresini yetiştirme yeteneği, embriyonik gelişim sırasında farklı deneysel pertürbasyonların etkisini karakterize etmek için değerli bir aracı temsil eder.
Introduction
Memeli embriyosunun intrauterin gelişimi postimplantasyon gelişiminin erken evrelerinin incelenmesini sınırlamıştır1,2. Gelişmekte olan embriyonun erişilemezliği, embriyo uterusa implante ettikten sonra meydana gelen hayvan vücut planının oluşturulması, mikrop katmanlarının belirtimi veya doku ve organların oluşumu gibi temel gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını engeller. Ayrıca erken postimplane embriyonun çok küçük olması E103 öncesi rahim içi görüntüleme ile gözlem yapmayı zorlaştırır. Bu aşamalarda canlı embriyoların gözlemlenememesi ve manipüle edilmesi, erken postimplantasyon embriyogenezinin çalışmasını gelişim sırasında anlık görüntülerle kısıtlamıştır.
Preimplantasyon memeli embriyolarının in vitro kültürü için protokoller iyi kurulmuş, güvenilir ve düzenli olarak kullanılmaktadır4. Bununla birlikte, uygun memeli postimplantasyon embriyo büyümesini destekleyebilen ex utero kültür sistemleri kurma girişimleri sınırlı başarıya sahipti5. Bir asırdan fazla bir süredir, embriyoların geleneksel statik plakalarda 6,7,8 veya dönen şişelerde (silindir kültürleri)5,9,10 kült haline getirildiği için çeşitli kültür teknikleri önerilmiştir. Bu platformlar, normal embriyo sağkalımında oldukça verimsiz olmasına ve kısa sürelerle sınırlı olmasına rağmen, implantasyondan sonra memeli gelişimi hakkındaki bilginin genişletilmesinde yardımcı olduğunu kanıtladı11,12. Embriyolar kültüre başladıktan sonra 24-48 saat gibi erken bir sürede gelişim geriliği ve morfolojik anomaliler göstermeye başladı.
Bu çalışma, pregastrülasyondan ileri organogenez evrelerine kadar altı güne kadar postimplantasyon gelişimine kadar sürekli gelişime izin veren ex utero embriyo kültür sistemini kurmak için ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır13. Bu makalede, E7.5 embriyolarının (sinir plakası ve baş kat aşaması) arka ekskülasyon aşamasına (~E11) kadar büyümesini destekleyen geliştirilmiş silindir kültürü protokolü ve kültürü statik plakalar ve silindir kültürü platformlarında birleştirerek E5.5/E6.5’ten genişletilmiş kültür açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan kültür protokolü, E5.5’ten E11’e kadar altı güne kadar uygun ve sürekli fare embriyosu geliştirme ex uterosunu sürdürebilir. Daha önce, bu gelişim aşamalarında embriyolar kültürde sadece kısa süreler için (48 saate kadar) normal olarak gelişebilirdi 15. Gaz regülasyon modülünün oksijen konsantrasyonunun ve hiperbarik gaz basıncının hassas kontrolü için silindir kültürü inkübatörüne kaplanması, burada açıklanan uygun fare embriyo kültür…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Pascal ve Ilana Mantoux tarafından finanse edildi; Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Konseyi (FAMRI); İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF) profesörlüğü, BSF, Helen ve Martin Kimmel Kök Hücre Araştırmaları Enstitüsü, Helen ve Martin Kimmel Yenilikçi Araştırma Ödülü; İsrail Bilim Vakfı (ISF), Minerva, Sherman Tıbbi Kimya Enstitüsü, Nella ve Leon Benoziyo Nörolojik Hastalıklar Merkezi, David ve Fela Shapell Genetik Bozukluklar Araştırma Merkezi, Kekst Aile Tıbbi Genetik Enstitüsü, Dr. Beth Rom-Rymer Kök Hücre Araştırma Fonu, Edmond de Rothschild Vakıfları, Zantker Hayır Kurumu, Zvia Zeroni Mülkü.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referenzen
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
