Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.
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Methodenartikel
Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chemisch induzierter Knochenverlust aufgrund von Bleiexposition (Pb) könnte eine Reihe nachteiliger Auswirkungen auf das Skelettsystem von Mensch und Tier haben. Die spezifischen Effekte und Mechanismen im Zebrafisch sind jedoch noch unklar. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen und kann helfen, den Knochen sichtbar zu machen und die skelettale Mineralmasse zu veranschaulichen. In dieser Studie zielten wir darauf ab, Bleiacetat (PbAc)-induzierten Knochenverlust in Zebrafischlarven durch Alizarin-Rotfärbung nachzuweisen. Zebrafischembryonen wurden mit einer Reihe von PbAc-Konzentrationen (0, 5, 10, 20 mg/L) zwischen 2 und 120 h nach der Befruchtung behandelt. Die gesamte Skelettfärbung wurde 9 Tage nach der Befruchtung an Larven durchgeführt, und die gesamte gefärbte Fläche wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die mineralisierten Gewebe rot gefärbt waren und der gefärbte Bereich in der PbAc-Expositions-Gruppe signifikant abnahm, mit einer dosisabhängigen Veränderung der Knochenmineralisierung. Dieser Artikel stellt ein Färbeprotokoll zur Untersuchung von Skelettveränderungen bei PbAc-induzierten Knochendefekten vor. Die Methode kann auch in Zebrafischlarven zum Nachweis von Knochenschwund verwendet werden, der durch andere Chemikalien induziert wird.
Einleitung
Neuere Studien haben bestätigt, dass Osteoporose aufgrund von Glukokortikoiden, Aromatasehemmern und übermäßigem Alkoholkonsum häufig ist 1,2. Blei (Pb) ist ein giftiges Metall, das in Pflanzen, Böden und Gewässern vorkommt3. Obwohl die nachteiligen Auswirkungen von Pb auf den menschlichen Körper viel Aufmerksamkeit erregt haben, muss seine irreversible Wirkung auf den Knochen weiter untersucht werden. Bleiintoxikation verursacht eine Vielzahl von pathologischen Veränderungen sowohl im sich entwickelnden als auch im erwachsenen Skelett, die normale Lebensaktivitäten beeinträchtigen. Stu....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden vom Animal Care Institute der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.
1. Fischzucht und Embryonenentnahme 14
- Füttern Sie Fische dreimal täglich; Stellen Sie sicher, dass die Zebrafische bei 28,5 ± 0,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 h gehalten werden.
- Trennen Sie die männlichen und weiblichen erwachsenen Fische abends durch Isolationsbretter in Laichbecken im Verhältnis 2:1 von Männchen zu Weibchen.
- Am nächsten Morgen entfernen Sie die Isolierplatten um 9:00 Uhr und sammeln die Embryonen 2 h s....
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Ergebnisse
Die Alizarin-Rotfärbung ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven. In dieser Studie haben wir beobachtet, dass PbAc nachteilige Auswirkungen auf Zebrafischlarven hatte, einschließlich Tod, Fehlbildung, verminderter Herzfrequenz und Körperlängenverkürzung. Darüber hinaus wurden die mineralischen Skelettbereiche von Zebrafischlarven ausgewertet, um den PbAc-induzierten Knochenverlust zu untersuchen. Bei 9 dpf (Abbildung 1A.......
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Diskussion
Der Zebrafisch ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung von Knochenstoffwechselerkrankungen. Im Vergleich zu Nagetiermodellen sind Zebrafischmodelle relativ schnell zu etablieren, und die Messung der Schwere der Erkrankung ist einfacher. Bei Wildtyp-Zebrafischlarven erfolgt die Mineralisierung des Kopfskeletts bei 5 dpf und des axialen Skeletts bei 7 dpf15. Daher sind Schädelknochen wie PS, OP, CB und NC bei 9 dpf gut entwickelt. Nachdem die Larven vollständig entfärbt und gebleicht waren, wurde.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) und der Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH=7,5) | Solarbio, Peking, China | 21 | zum Zurückhalten von |
| 4% Paraformaldehyd Fixierlösung | BBI,Shanghai,China | 14 | Fixiergewebe |
| 10x PBS-Puffer | BBI,Shanghai,China | 15 | zum Fixieren |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | zum Entfernen von Pigmenten |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | AKX, Jiangsu, China | 4 | |
| 95% wasserfreies Ethanol | Enox, Jiangsu, China | 2 | Entfärbung |
| Alizarin rot (Reinheit 99,5%) | Solarbio, Peking, China | 1 | Färbung |
| Biochemischer Inkubator | Yiheng, Shanghai, China | 3 | Aufzucht von Zebrafischembryonen |
| Elektronische Waage | Sartorius, Deutschland | 5 | Wiegen der festen Rohstoffe |
| Glycerin (Reinheit 99,5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | Lagerung des gefärbten Fisches |
| ImageJ (Software) | USA | 9 | digitale Analyse |
| KOH (Reinheit 99,9%) | Sigma,Amerika | 10 | Bleichlösung |
| Bleiacetat-Trihydrat (Reinheit 99,5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Reinheit 99,9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | Reinigungslösung |
| NIS-Elements F (Software) | Nikon, Japan | 13 | Beobachten und Fotografieren |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | Entnahme von Embryonen und Lösungsplatten |
| (24-Well) | Corning,Amerika | 17 | Behälter zum Färben von Embryoplatten |
| (6-Well) | Corning,Amerika | 16 | Behälter für die Zucht von Embryonen |
| Rütteltisch | Beyotime, China | 19 | Mischen der Lösung |
| Stereomikroskop | Nikon, Japan | 20 | Beobachten und Fotografieren |
| Zebrafisch | Zebrafisch Experiment Center der Soochow University, Suzhou, China | 22 | Versuchstier |
Referenzen
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbau....
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Nachdrucke und Genehmigungen
