Summary
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.
Abstract
Der größte Teil der Energie der Zelle wird durch den Abbau von Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren über verschiedene Wege gewonnen, die auf dem mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystem (OXPHOS) zusammenlaufen, das als Reaktion auf zelluläre Anforderungen reguliert wird. Das Lipidmolekül Coenzym Q (CoQ) ist in diesem Prozess essentiell, indem es Elektronen durch konstante Oxidations- / Reduktionszyklen in den Komplex III in der Elektronentransportkette (ETC) überträgt. Der Zustand der Mitochondrien und letztendlich die Zellgesundheit können durch Messung des ETC-Sauerstoffverbrauchs mithilfe von respirometrischen Assays beurteilt werden. Diese Studien werden typischerweise in etablierten oder primären Zelllinien durchgeführt, die mehrere Tage lang kultiviert wurden. In beiden Fällen können die erhaltenen Atmungsparameter von den normalen physiologischen Bedingungen in einem bestimmten Organ oder Gewebe abgewichen sein.
Darüber hinaus behindern die intrinsischen Eigenschaften von kultivierten Einzelfasern, die aus der Skelettmuskulatur isoliert wurden, diese Art der Analyse. Dieses Papier stellt ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll für die Analyse der Atmung in frisch isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus vor. Wir bieten auch Lösungen für potenzielle Probleme, die in jedem Schritt des Prozesses auftreten können. Die hier vorgestellte Methode könnte angewendet werden, um Sauerstoffverbrauchsraten in verschiedenen transgenen Mausmodellen zu vergleichen und die mitochondriale Reaktion auf medikamentöse Behandlungen oder andere Faktoren wie Altern oder Geschlecht zu untersuchen. Dies ist eine praktikable Methode, um auf entscheidende Fragen zum mitochondrialen bioenergetischen Stoffwechsel und zur Regulation zu antworten.
Introduction
Mitochondrien sind die primären Stoffwechselorganellen in der Zelle1. Diese spezialisierten membranumschlossenen Organellen verwenden Nährstoffmoleküle, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) von OXPHOS zu erzeugen. Dieser Prozess beruht auf dem Transfer von Elektronen aus Donormolekülen in einer Reihe von Redoxreaktionen im ETC2. CoQ ist das einzige redoxaktive Lipid, das endogen in allen Zellmembranen und zirkulierenden Lipoproteinen produziert wird und eine antioxidative Funktion zeigt3. Es ist ein wesentlicher Bestandteil des ETC und überträgt Elektronen vom NADH-abhängigen Komplex I und FADH2-abhängigen Komplex II auf den Komplex III, obwohl viele andere Reduktasen die Reduktion von mitochondrialem CoQ zu Ubiquinol als obligatorischen Schritt in mehreren zellulären Stoffwechselwegen vorantreiben können4,5.
Während des gesamten Prozesses wird ein elektrochemischer Protonengradient über die mitochondriale innere Membran erzeugt, der durch den ATP-Synthasekomplex V2 in biologisch aktive Energie umgewandelt wird. Folglich führt die mitochondriale Dysfunktion zu einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, die hauptsächlich Gewebe mit hohem Energiebedarf betreffen - Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur6,7. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, Methoden zur genauen Analyse der mitochondrialen Bioenergetik zu entwickeln, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, insbesondere in hochenergetischen Geweben wie der Skelettmuskulatur.
Die Clark-Sauerstoffelektrode wurde klassischerweise bei der Untersuchung der mitochondrialen Atmung8 verwendet. Dieses System wurde jedoch zunehmend durch Technologien mit höherer Auflösung ersetzt, wobei mikroplattenbasierte Sauerstoffverbrauchstechnologien wie Agilent Seahorse XF-Analysatoren besonders beliebt sind9. Im Bereich der Skelettmuskulatur werden diese Studien typischerweise in kultivierten Zellen durchgeführt, hauptsächlich in der C2C12-immortalisierten Maus-Myoblasten-Zelllinie oder Primärkulturen, die von Satellitenzellen abgeleitet wurden10,11. Diese Studien rekapitulieren die Situation jedoch nicht vollständig in vivo, insbesondere bei der Untersuchung der mitochondrialen Biologie und der Funktion auf Gewebeebene bei spezifischen Beleidigungen, nichtgenetischen Eingriffen oder genetischen Manipulationen.
Darüber hinaus sind die Atmungstests in Zellen aufgrund zusätzlicher Faktoren komplexer, einschließlich des extramitochondrialen Bedarfs an ATP- und Assay-Substraten oder Signalereignissen, die die Interpretation der Ergebnisse in die Irre führen könnten. Alternativ ist es auch möglich, einzelne oder Bündel von frisch isolierten Myofasern aus Muskeln zu verwenden. Die Isolationsmethode ist jedoch technisch anspruchsvoll und nur für wenige Muskeltypen machbar. In diesem Fall werden hauptsächlich die Muskeln Flexor digitorum brevis (FDB) und Extensor digitorum longus (EDL) verwendet10,12,13, obwohl einige Berichte auch die Verwendung anderer Muskeltypen beschreiben14,15.
Eine bioenergetische Profilierung von Skelettmuskelabschnitten wurde ebenfalls berichtet16. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass intakte Muskeln untersucht werden können (die Autoren zeigen, dass das Durchschneiden von Fasern die Ergebnisse im Vergleich zu isolierten Myofasern nicht stört). Der mitochondriale Zugang zu Substraten und Assay-Inhibitoren ist jedoch begrenzt, so dass nur wenige Parameter gemessen werden können16. Schließlich können auch isolierte Mitochondrien eingesetzt werden9,17,18,19. In diesem Fall verlieren Mitochondrien ihre zytosolische Umgebung, was ihre Funktion beeinträchtigen könnte. Im Gegensatz dazu garantiert diese Methode den Zugang zu Substraten und Inhibitoren, ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Probentypen und benötigt typischerweise weniger Material.
Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Durchführung der bioenergetischen Profilierung von isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays (Abbildung 1). Insbesondere werden drei Protokolle detailliert beschrieben: der Coupling Assay, CA zur Beurteilung des Grades der Kopplung zwischen der ETC- und der OXPHOS-Maschine; der Elektronenfluss-Assay, EFA zur Messung der Aktivität der einzelnen ETC-Komplexe; und der BOX-Assay zur Bestimmung der mitochondrialen β-Oxidationskapazität. Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Respirometrie nur geringe Mengen an Proben benötigt werden. Das hier verwendete Isolationsprotokoll wurde gegenüber der an anderer Stelle veröffentlichten Methode geändert18.
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Protocol
Mausgehäuse und Gewebeentnahme wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanien; Protokolle 24/04/2018/056 und 12/03/2021/033) in Übereinstimmung mit dem spanischen Königlichen Dekret 53/2013, der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und anderen relevanten Richtlinien genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Beständen, Puffern und Reagenzien für die Atmungstests
- Bereiten Sie die folgenden Lagerlösungen vor, die monatelang bei der angegebenen Temperatur gelagert werden können. Verwenden Sie in allen Fällen hochreines H2O.
- Lösen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten in H2O (1 Tablette pro 200 ml H2O) auf, um 1x PBS herzustellen. Autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
- Lösen Sie 2 g NaOH-Pellets in 50 ml H2O auf, um 1 M NaOH herzustellen.
- Bereiten Sie 0,1 M, 1 M, 5 M und 10 M KOH-Bestände für die pH-Kalibrierung vor.
- 14,612 g EDTA zu 70 ml H2O hinzufügen. NaOH-Pellets hinzufügen, bis der pH-Wert 8,0 erreicht, so dass sich EDTA vollständig auflöst. H2O quantum satis (QS) zu 100 ml hinzufügen. Autoklavieren Sie die resultierende 0,5 M EDTA (pH 8) Lösung und lagern Sie sie bei RT.
- Fügen Sie 19 g EGTA zu 70 ml H2O hinzu. Fügen Sie NaOH-Pellets hinzu, bis der pH-Wert 8,0 erreicht, damit sich die EGTA vollständig auflösen kann. H2O QS zu 100 ml hinzufügen. Autoklavieren Sie die resultierende 0,5 M EGTA (pH 8) Lösung und lagern Sie sie bei RT.
- Fügen Sie 2 ml 0,5 m EDTA zu 98 ml PBS hinzu. Speichern Sie die resultierende 10 mM EDTA/PBS-Lösung bei RT.
- 5,958 g HEPES in 40 mL H2O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 mit KOH und QS auf 50 ml mit H2O ein. Filtern Sie den resultierenden 0,5 M HEPES-Puffer durch ein 0,45-μm-Netz und lagern Sie ihn bei RT.
- 3,402 g KH2PO4 in bis zu 50 ml H2O lösen. Filtern Sie die resultierende 0,5 M KH2PO4-Lösung durch ein 0,45 μm-Netz und lagern Sie sie bei RT.
- 9.521 g wasserfreies MgCl2 in bis zu 100 mL H2O auflösen. Autoklavieren Sie die resultierende 1 M MgCl2-Lösung und lagern Sie sie bei RT.
HINWEIS: Da es sich um eine exotherme Reaktion handelt, gehen Sie vorsichtig vor und lösen Sie das MgCl2 auf Eis auf.
- Herstellung von Substrat- und Inhibitor-Stammlösungen (siehe Tabelle 1). Aliquot und lagern Sie sie bei -20 °C. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen. Bereiten Sie ausnahmsweise Brenztraubensäure immer unmittelbar vor der Anwendung vor.
- Herstellen in ultrareinem H2O: 0,5 M Succinat, 0,5 M Brenztraubensäure, 0,5 M Apfelsäure, 100 mM ADP, 1 M Ascorbinsäure und 50 mM N,N,N′,N′-Tetramethyl-para-phenylen-diamin (TMPD) (vor Licht schützen).
- Herstellen in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO): 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 4 mM Rotenon, 20 mM Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP), 4 mM Oligomycin und 5 mM Antimycin A.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 0,1% End-DMSO-Konzentration in den Mikrotiterplattenvertiefungen. Bereiten Sie daher hochkonzentrierte Lagerlösungen vor, um unter diesem Grenzwert zu bleiben.
- Bereiten Sie die Puffer für die Isolierung der Mitochondrien und die Proteinquantifizierung am Tag des Experiments frisch vor. Verwenden Sie in allen Fällen hochreines H2O und bewahren Sie alle Puffer auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.
HINWEIS: Um Zeit zu sparen, können alle Reagenzien gewogen und in den entsprechenden Behältern (z. B. 15-ml-Röhrchen) bei der richtigen Temperatur am Vortag aufbewahrt werden.- Um 10% freie Fettsäuren (FFA) BSA herzustellen, lösen Sie 150 mg FFA BSA gründlich in 1,5 ml H2O durch Inversion / Drehrad auf. Wirbeln Sie nicht, um Schaumbildung zu vermeiden.
- Um 1x Bradford-Reagenz herzustellen, verdünnen Sie die 5x kommerzielle Lagerlösung mit H2O und halten Sie sie bei RT im Dunkeln.
- Um 8x Mitochondria Buffer (MB) herzustellen, lösen Sie 4,112 g Saccharose und 763 mg HEPES in 15 ml H2O auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, fügen Sie 1,6 ml 10% FFA BSA und QS zu 20 ml mit H2O hinzu.
- Zur Herstellung von 20 ml Isolationspuffer 1 (IB1) (4 ml pro Probe) werden 400 μL 0,5 m EDTA, 784 mg D-Mannit und 2,5 ml 8x MB in 15 ml H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
- Zur Herstellung von 5 ml Isolationspuffer 2 (IB2) (500 μL pro Probe) werden 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-Mannit und 625 μL 8x MB in 4 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
- Zur Herstellung von 5 ml Resuspension Buffer (RB) (200 μL pro Probe) werden 120 mg Saccharose, 191,3 mg D-Mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES und 10 μL 0,5 M EGTA in 4 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
- Zur Herstellung von 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) werden 1,199 g Saccharose, 2,8 g Mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES und 100 μL 0,5 M EGTA in 20 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS auf 25 ml mit H2O ein. Halten Sie es für längere Zeit bei 4 ° C, um Niederschläge zu vermeiden.
- Um 1x Coupling Assay Medium (CAM) vorzubereiten, bereiten Sie zwei verschiedene MAS-1-basierte Puffer vor: 1) CAM+BSA für den eigentlichen CA-Assay und 2) CAM-BSA für die Vorbereitung der Assay-Inhibitoren. Halten Sie das Pyruvat:Malat-Verhältnis immer bei 10:1.
HINWEIS: Da BSA die Injektionsanschlüsse verstopfen kann, verdünnen Sie die Inhibitoren in BSA-freiem CAM.- Zur Herstellung von CAM+BSA werden 300 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 30 μL 0,5 M Apfelsäure und 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
- Zur Herstellung von CAM-BSA werden 120 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 12 μL 0,5 M Apfelsäure und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert mit H2O auf 7,2 und QS auf 6 ml ein.
- Um 1x Electron Flow Assay Medium (EFAM) herzustellen, bereiten Sie sowohl BSA-haltige als auch BSA-freie EFAM-Puffer vor.
- Zur Herstellung von EFAM+BSA werden 300 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 60 μL 0,5 M Apfelsäure, 3 μL 20 mM FCCP und 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
- Zur Herstellung von EFAM-BSA werden 120 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 24 μL 0,5 M Apfelsäure, 1,2 μL 20 mM FCCP und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert mit H2O auf 7,2 und QS auf 6 ml ein.
- Zur Herstellung von 1x β-Oxidationsmedium (BOXM) stellen Sie BSA-haltige und BSA-freie BOXM-Lösungen her.
- Zur Herstellung von BOXM+BSA werden 12 μL 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 30 μL 0,5 M Apfelsäure und 7,5 ml 2x MAS-1 in 7 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
- Zur Herstellung von BOXM-BSA werden 4,8 μL 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 12 μL 0,5 M Apfelsäure und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS auf 6 ml mit H2O ein.
2. Muskeldissektion, Homogenisierung und mitochondriale Isolierung
- Alle Materialien und Puffer auf Eis legen. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien während des gesamten Verfahrens eiskalt sind, um die Mitochondrien vor Schäden zu schützen.
- Legen Sie drei 50-ml-Bechergläser pro Probe auf Eis und fügen Sie die folgenden Lösungen hinzu: 10 ml PBS in Becherglas 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS in Becherglas 2 und 4 ml IB1 in Becherglas 3.
- Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixdislokation. Vermeiden Sie CO2-Euthanasie, da die Skelettmuskulatur hypoxisch werden und die Atmungsanalysen beeinträchtigen könnte.
- Besprühen Sie das rechte Hinterbein mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell abfällt, und kleben Sie das Glied auf die Kork-Dissektionsplatte. Kleben Sie auch das linke Vorderbein ab.
- Machen Sie einen Schnitt mit einem sterilen Einwegskalpell durch die Haut vom Knie bis zu den Zehen.
- Greifen Sie die Haut mit einer gezähnten Pinzette auf Knöchelhöhe und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere um den Knöchel.
- Erleichtern Sie die Haut von der darunter liegenden Muskulatur mit einer Pinzette mit feiner Spitze in der einen Hand, während Sie sie mit einer gezähnten Pinzette in der anderen Hand hochziehen.
- Sezieren Sie alle Skelettmuskeln vom Knöchel bis zum Knie (Abbildung 2).
- Entfernen Sie das gesamte Bindegewebe über dem Musculus tibialis anterior (TA), um die Muskelextraktion mit einer feinen Pinzette und einer Schere zu erleichtern.
- Finden Sie die vier distalen Sehnen des EDL-Muskels und schneiden Sie sie in der Nähe ihrer Insertionen in die Zehen. Suchen Sie die distale TA-Sehne und schneiden Sie sie in der Nähe ihres Einsetzens, immer unterhalb des Knöchels.
- Ziehen Sie vorsichtig die TA- und EDL-Sehnen über den Knöchel, um die losen Enden zu befreien.
- Greifen Sie die losen Enden der Sehnen und entspannen Sie die Muskeln vom Rest der Muskulatur und der Knochen, indem Sie sie hochziehen. Verwenden Sie eine feine Pinzette oder eine Schere, um den Prozess zu erleichtern. Gehen Sie vorsichtig vor, um eine Myofaserkontraktion zu vermeiden.
- Schneiden Sie die proximale Sehne der EDL und den TA-Muskel so nah wie möglich an der Kniescheibe ab.
- Drehen Sie die Maus auf den Kopf, um mit der Extraktion von Gastrocnemius (GA) und Soleusmuskeln fortzufahren.
- Greifen Sie die zwischen dem Bizeps femoris und der GA gebildete Tasche mit einer Zahnzange. Verwenden Sie eine feine Schere, um diese Muskeln zu trennen und die proximale GA-Sehne zu visualisieren.
- Greifen Sie die Achillessehne mit einer feinen Pinzette und schneiden Sie sie vorsichtig mit einer feinen Schere. Lösen Sie die GA- und Soleusmuskeln aus dem darunter liegenden Knochen, indem Sie sie durch ihre Sehnen nach oben ziehen. Schneiden Sie die proximale GA-Sehne ab und befreien Sie sie zusammen mit dem darunter liegenden Soleus.
- Sezieren Sie vorsichtig die verbleibenden Muskeln von Sehne zu Sehne nach dem gleichen Verfahren, bis nur noch Knochen übrig sind.
- Heften Sie die Maus in der Ausgangsposition erneut an, um den Quadrizepsmuskel zu sezieren.
- Entsorgen Sie das Fettgewebe über dem Quadrizeps an der proximalen Seite mit einer gezähnten Pinzette und einer feinen Schere.
- Führen Sie eine feine Pinzette zwischen den Quadrizeps und den Femur ein und bewegen Sie sie in beide Richtungen entlang der Femurachse, um den Muskel vom Knochen zu trennen.
- Greifen Sie die distalen Quadrizeps-Muskelsehnen mit einer gezähnten Pinzette und schneiden Sie die Sehne mit einer feinen Schere so nah wie möglich an der Kniescheibe ab.
- Ziehen Sie den Quadrizeps nach oben und befreien Sie ihn am proximalen Einsetzen mit einer feinen Schere.
- Wiederholen Sie die Schritte 4 bis 8 aus diesem Abschnitt mit dem linken Hinterbein.
- Spülen Sie alle Muskeln zuerst in Becherglas 1 und dann in Becherglas 2.
- Übertragen Sie alle Muskeln auf Becher 3 und hacken Sie alle Muskeln mit einer scharfen Schere auf dem Eis fein ab.
- Übertragen Sie die Aufhängung auf ein C-Rohr (violetter Deckel) und halten Sie es immer in Eis.
- Schließen Sie das C-Rohr fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse des Homogenisators. Stellen Sie sicher, dass sich das Probenmaterial im Bereich des Rotators/Stators befindet. Wählen Sie das 1-minütige Programm m_mito_tissue_01 aus.
- Teilen Sie das Homogenat in zwei 2 ml vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 700 × g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.
- Übertragen Sie die Überstände auf neue vorgekühlte 2-ml-Schläuche und vermeiden Sie vorsichtig Fett und nicht homogenisiertes Gewebe. Lagern Sie die Pellets bei -80 °C zur Bestimmung der Reinheit der Fragmentierung (Fraktion N) (Abbildung 3).
- Die Überstände bei 10.500 × g zentrifugieren für 10 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie die Überstände auf neue 2 ml vorgekühlte Röhrchen und kennzeichnen Sie sie als Überstand Nummer 1 (SN1). Lagern Sie sie bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
- Resuspendieren und kombinieren Sie beide Pellets in einem Gesamtvolumen von 500 μL IB2 in Eis.
- Zentrifuge bei 10.500 × g für 10 min bei 4°C.
- Überführen Sie den Überstand in ein neues 2 ml vorgekühltes Röhrchen und kennzeichnen Sie es als Überstand Nummer 2 (SN2). Lagern Sie es bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
- Resuspendiert das letzte mitochondriale Pellet in 200 μL RB. Stellen Sie schnell 10 μL für die Proteinquantifizierung beiseite und fügen Sie sofort 10 μL 10% FFA BSA zu der verbleibenden mitochondrialen Suspension hinzu, um Schäden zu vermeiden.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.
- Für die Standardkurve bereiten Sie 30 μL serielle Verdünnungen der bekannten Konzentration eines Proteins im RB-Puffer vor. Verwenden Sie beispielsweise 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,0625 mg / ml und 0 mg / ml BSA.
- Bereiten Sie serielle 1:3- und 1:6-Verdünnungen der mitochondrialen Proben im RB-Puffer vor.
- In einer 96-Well-Flat-Bottom-Platte laden Sie zuerst 2,5 μL Probe/Standard pro Well. Als nächstes fügen Sie jeder Probe 10 μL 1 M NaOH und schließlich 200 μL 1x Bradford-Reagenz hinzu. Gut mischen und Luftblasen vermeiden. Überprüfen Sie visuell, ob sich die Farbe der Proben innerhalb der Kalibrierungslinie befindet. Führen Sie die Analyse immer dreifach durch.
- Inkubieren Sie die Platten für 5 min bei RT im Dunkeln und lesen Sie die Absorption bei 595 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer ab.
- Berechnen Sie die Standardkurve, indem Sie die Absorptionswerte (y-Achse) gegenüber der entsprechenden Proteinkonzentration der in Schritt 22.1 in diesem Abschnitt (x-Achse) hergestellten Verdünnungen aufzeichnen.
- Berechnen Sie die Gesamtmenge an Protein in den mitochondrialen Proben durch Extrapolation mit der Standardkurve.
3. Erstellung der mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays
- Hydratisieren Sie den respirometrischen Assay-Sensor mindestens 12 Stunden vor dem Experiment mit 1 ml Kalibrierpuffer pro Bohrloch. Bei 37 °C (kein CO2) inkubieren.
HINWEIS: Hydratisierte Sensoren können bis zu 72 h lang verwendet werden. Die Kartusche sollte in diesem Schritt vorsichtig gehandhabt werden: Wenn etwas die Sensoren berührt, könnte die Messempfindlichkeit beeinträchtigt werden. - Die präparative Zentrifuge mit dem Schwenklöffel-Mikroplattenrotor und den entsprechenden Mikrotiterplattenadaptern bei 4 °C vorkühlen.
- Schalten Sie den Computer ein, öffnen Sie die Analysesoftware und wählen Sie das gewünschte Protokoll aus.
HINWEIS: Ein Klicken ist zu hören, wenn die Software eine Verbindung zum Sauerstoffverbrauchsmessgerät herstellt. Der Heizsensor sollte grün und bei 37 °C sein, bevor das Experiment beginnt. - Bereiten Sie die Inhibitorlösungen aus den in Abschnitt 1, Schritt 2 angegebenen Beständen gemäß dem durchzuführenden Assay vor. Bereiten Sie genügend Volumen für jede Lösung vor. Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 als Referenz.
- Fügen Sie das entsprechende Volumen jedes Inhibitors in jeden Anschluss hinzu, setzen Sie die Kartusche in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ein und beginnen Sie mit der Kalibrierung.
HINWEIS: Das Hinzufügen von Inhibitor zur Kartusche und das Einsetzen der Patrone in das Instrument dauert 15-20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Kartuschenkomponenten eingeführt werden. Der Patronendeckel und der Hydro-Booster könnten entsorgt werden, während die Sensorpatrone und der Platz des Dienstprogramms benötigt werden. - Zentrifugieren Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension von Abschnitt 2, Schritt 21 bei 10.500 × g für 10 min bei 4 °C.
- Resuspendiert das mitochondriale Pellet in 100 μL 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA oder 1x BOXM+BSA, je nach durchzuführendem Protokoll.
- Die konzentrierte mitochondriale Probe wird im entsprechenden Assay-Medium weiter auf eine endgültige Konzentration von 0,2 μg/μL verdünnt.
- Samen Sie 50 μL der Suspension (insgesamt 10 μg Protein) pro Vertiefung in einer vorgekühlten 24-Well-Mikroplatte auf Eis. Fügen Sie keine Mitochondrien in den Hintergrundkorrekturbrunnen hinzu; Fügen Sie nur das entsprechende Assay-Medium hinzu. Lagern Sie die verbleibende mitochondriale Suspension bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
- Drehen Sie die Mikrotiterplatte in der vorgekühlten präparativen Zentrifuge bei 2.000 × g für 20 min bei 4 °C. Gegengewicht, um entsprechend auszugleichen.
- Das verbleibende Assay-Medium wird während der Mikrotiterplattenzentrifugation bei 37 °C erwärmt.
- Lassen Sie die Mikrotiterplatte nach der Zentrifugation 5 Minuten auf der Bank, um sich auszugleichen. 450 μL warmes Assay-Medium für ein Endvolumen von 500 μL pro Bohrloch bei RT hinzufügen. Tun Sie dies langsam und vorsichtig, indem Sie das Medium an die Wand der Brunnen geben, um eine Ablösung der Mitochondrien zu vermeiden.
- Legen Sie die Mikroplatte sofort in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ohne Deckel und starten Sie das Protokoll (Tabelle 3). Stellen Sie sicher, dass der erste Schritt eine 10-minütige Inkubation ist, damit sich die Mikrotiterplatte erwärmen kann.
- Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Kartusche und die Mikrotiterplatte, schalten Sie das Gerät aus und starten Sie die Analyse.
4. Analyse der Ergebnisse
- Führen Sie im Falle der CA- und BOX-Assays die folgenden Analysen durch:
- Erfassen Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch , der dem Mittelwert der Werte entspricht, die nach der Injektion von Antimycin A und Rotenon erhalten wurden.
HINWEIS: Antimycin A und Rotenon sind komplexe III- bzw. I-Hemmer. - Berechnen Sie die Basalatmung, indem Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Basalwerten (Messpunkte 1 und 2) abziehen.
- Subtrahieren Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Werten nach der Injektion des komplexen V-Substrats ADP (Injektion A), um den mitochondrialen Zustand III zu bestimmen.
- Subtrahieren Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Atmungswerten nach der Injektion des komplexen V-Inhibitors Oligomycin (Injektion B), um den mitochondrialen Zustand IVo zu erhalten.
- Berechnen Sie den mitochondrialen Zustand IIIu, indem Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von der Atmung nach der FCCP-Injektion (Injektion C) abziehen.
HINWEIS: FCCP ist ein potenter mitochondrialer oxidativer Phosphorylierungsentkoppler. Die ATP-Synthese wird in ihrer Gegenwart umgangen, und das ETC erreicht maximale Aktivität. - Subtrahieren Sie die basalen Atmungswerte von den IIIu-Werten des mitochondrialen Zustands, um die mitochondriale Reservekapazität zu erhalten, die die Fähigkeit zur Erzeugung von zusätzlichem ATP im Falle eines erhöhten Energiebedarfs darstellt.
- Teilen Sie den mitochondrialen Zustand IIIu durch die Werte des Zustands IVo, um das Atemkontrollverhältnis (RCR) zu erhalten.
HINWEIS: Negative oder Null-RCR-Werte weisen darauf hin, dass die mitochondriale Kopplung betroffen ist.
- Erfassen Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch , der dem Mittelwert der Werte entspricht, die nach der Injektion von Antimycin A und Rotenon erhalten wurden.
- Führen Sie in Bezug auf die EFA die folgenden Berechnungen durch:
- Erhalten Sie die Restaktivität, indem Sie den Mittelwert nach der Rotenon- und Antimycin-A-Injektion (Injektionen A und C) berechnen.
- Berechnen Sie die Aktivität des Komplexes I bis IV (ci-civ), indem Sie die Restaktivität von den Basalwerten (Messpunkte 1 und 2) subtrahieren.
- Subtrahieren Sie die Restaktivität von den Werten nach der Injektion des CII-Substratsuccinats (Injektion B), um eine CII-CIII-CIV-Aktivität zu erhalten.
- Berechnen Sie die CIV-Aktivität, indem Sie die Restaktivität von den Werten abziehen, die nach der Injektion der Cytochrom-c-Reduktionsmittel, Ascorbinsäure und TMPD (Injektion D) erhalten werden.
- Stellen Sie alle Ergebnisse mithilfe von Balkendiagrammen dar, wie in Abbildung 4 dargestellt, um geeignete Schlussfolgerungen zu extrahieren.
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Representative Results
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die In-vivo-Analyse der mitochondrialen Atmung durch die Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Ein Überblick über die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Sezierung der Skelettmuskulatur von den Hinterbeinen (Abbildung 2) werden die Gewebe homogenisiert und die Mitochondrien unter isotonischen Bedingungen durch serielle Zentrifugationen gereinigt. Die Reinheit der verschiedenen Fraktionen, die während des Isolationsprozesses erhalten werden, kann durch Western Blot unter Verwendung von Antikörpern gegen verschiedene Organellenmarker analysiert werden. Abbildung 3A zeigt das allgemeine Proteinprofil aus den verschiedenen Fraktionen, das unterschiedliche Proteinpopulationen in den isolierten Fraktionen zeigt.
Abbildung 3B zeigt, dass der gesamte mitochondriale Gehalt in der mitochondrialen Fraktion liegt, wie die starken Signale für Marker der äußeren (VDAC und TOMM20) und inneren (TIMM23) Mitochondrienmembranen und sogar für Nukleoid-assoziierte Proteine (mtTFA) belegen. Alle Kerne und das Zytoskelett (β-Aktin) sind in der Fraktion N vorhanden, die Kerne und ungestörtes Material darstellt (Abbildung 3C). Darüber hinaus verbleiben die meisten endoplasmatischen Retikulum- (ER) (Calnexin), Plasmamembran (Na+/K+-ATPaseα1) oder Zytoplasmamarker (LDHA, HSP70 oder AKT) in den SN1- oder SN2-Fraktionen, was die hohe Reinheit hervorhebt, die während der Isolierung erhalten wurde (Abbildung 3C). Es gibt jedoch einige Spuren einer ER-Kontamination in der mitochondrialen Fraktion, möglicherweise aufgrund der Nähe dieser Organellen. Angesichts der Ergebnisse, die in nachfolgenden Atemwegstests erzielt wurden, liefert das hier beschriebene Isolationsverfahren hochreine, lebensfähige mitochondriale Präparate.
Sowohl CA- als auch BOX-Assays ermöglichen die Berechnung verschiedener mitochondrialer Zustände in Gegenwart mehrerer Substrate, die bestimmte Stoffwechselwege stimulieren. Insbesondere werden diese Assays in Gegenwart von Brenztraubensäure oder Palmitoyl-L-Carnitinchlorid durchgeführt. Brenztraubensäure ist ein Substrat des Krebszyklus; Apfelsäure ist ein Krebs-Zyklus-Vermittler und ein NADH-Induktor, während Palmitoyl-L-Carnitin ein Substrat des Fettsäure-β-Oxidationsweges ist. (Abbildung 4A,B). In beiden Assays ist der erste Zustand, der gemessen werden kann, die basale Atmungsrate, die die mitochondriale Atmung in Gegenwart der Substrate darstellt, die ursprünglich dem Assay-Medium hinzugefügt wurden. Dann wird der mitochondriale Zustand III erreicht, der die ATP-Produktion aus ADP und anorganischem Phosphat darstellt und die maximale Atmung in einem gekoppelten Zustand zeigt. Somit kommt es zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs nach ADP-Addition, wie in Abbildung 4A,B beobachtet.
Darüber hinaus zeigt der Zustand IVo das Protonenleck an, das mit der Hemmung der ATP-Synthase durch Oligomycin verbunden ist, was zu einer Abnahme der Atmung führt, wie in den CA- und BOX-Diagrammen beobachtet (Abbildung 4A, B). Die Zugabe von FCCP führt zum Zustand IIIu, der die maximale Atmungskapazität zeigt, die Mitochondrien in einem entkoppelten Zustand aufweisen können, wenn der Sauerstoffverbrauch in diesen Assays seinen höchsten Stand erreicht. Um all diese Zustände zu berechnen, ist es zunächst von grundlegender Bedeutung, die nicht-mitochondriale Atmung zu bestimmen, die am Ende des Assays erhalten wird, wenn Antimycin A und Rotenon injiziert werden, um die oxidative Atmung zu hemmen. Wie in Abbildung 4A,B gezeigt, müssen diese Werte bei Assays mit isolierten Mitochondrien wie diesen hier beschriebenen Assays immer unter der Basalatmung und sehr nahe Null liegen. Schließlich muss der RCR-Parameter berechnet werden, um die mitochondriale Integrität zu beurteilen. Es spiegelt wider, ob Mitochondrien auf ADP reagieren können, indem sie ATP mit einer hohen Rate mit einem geringen Protonenleck produzieren. Die mittleren RCR-Werte in den CA- und BOX-Assays betrugen 5,78 ± 1,03 bzw. 3,47 ± 0,42 (Abbildung 4A,B), die mit den zuvor gemeldeten optimalen RCRs übereinstimmen21,22,23,24.
Darüber hinaus untersucht die EFA die Aktivität der ETC-Komplexe einzeln oder in Kombination durch die Injektion spezifischer Substrate und Inhibitoren (Abbildung 4C). Die CI-CIV-Aktivität stellt die mitochondriale Atmung auf der Basis von Pyruvat- und Malatsubstraten dar, wenn keine Komplexe gehemmt werden; In diesem Fall durchlaufen die meisten Elektronen CI. Da Rotenon ein spezifischer Inhibitor von CI ist, wird CI nach seiner Zugabe blockiert, was zu einem verringerten Sauerstoffverbrauch führt (Abbildung 4C). Die CII-CIII-CIV-Aktivität zeigt die Atmung, wenn nur CI blockiert und CII aktiviert wird: Succinat, das durch Port B injiziert wird, ist ein spezifisches Substrat des Komplexes II (Succinat-Dehydrogenase). So wird CII reduziert, wodurch der Elektronenfluss von CII zu CIV eingeleitet wird, während CI durch die vorherige Rotenoninjektion noch gehemmt wird, was zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs führt (Abbildung 4C). Antimycin A-Zugabe hemmt CIII, blockiert den Elektronenfluss durch das ETC und reduziert den Sauerstoffverbrauch. Darüber hinaus wird die CIV-Aktivität bestimmt, wenn sie durch Cytochrom-C-Oxidation stimuliert wird, nachdem sie durch die Zugabe von Ascorbinsäure / TMPD reduziert wurde; Abbildung 4C zeigt, dass die CIV-Aktivierung zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs führt. Schließlich bezieht sich die Restaktivität auf den Sauerstoffverbrauch, wenn die oxidative Phosphorylierungskette nach der Zugabe von Rotenon und Antimycin A inaktiviert wird. Dieser Wert bildet den Hintergrund für die Berechnung der Aktivität der Komplexe, wie in den Protokollschritten 2.2-2.4 in Abschnitt 4 angegeben.
Abbildung 1: Schematische Visualisierung der Methode. Abkürzungen: OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; OL = Oligomycin; FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; AntA = Antimycin A; Fäulnis = Rotenon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dissektion und Isolierung der murinen Skelettmuskulatur von den Hinterbeinen für mitochondriale Atmungsanalysen . (A) Das rechte Hinterbein wurde gedehnt und mit Klebeband immobilisiert. (B) Ein Schnitt wurde durch die Haut von neben dem Knöchel gemacht, der proximal zum Knie stoppte. Bindegewebe über der TA wurde vorsichtig entfernt. EDL (C) und TA (D) Sehnen wurden in der Nähe ihrer Insertionen geschnitten. Die TA-Sehne wurde hochgezogen, um den Muskel von der darunter liegenden Muskulatur und dem Knochen zu befreien. Dann wurde der TA in der Nähe des Bauchkamms zur Tibia geschnitten. In ähnlicher Weise wurde der EDL-Muskel erleichtert und die proximale Sehne wurde akribisch an der Seite des Knies geschnitten. (F) Rechtes Hinterbein nach TA- und EDL-Dissektion. (G) Im hinteren Hinterbein wurde die Achillessehne geschnitten, um die Muskulatur GA und Soleus zu sezieren. (H) GA und Soleus wurden vorsichtig aus dem Tibiaknochen befreit. (I) Die verbleibenden Muskeln wurden vom Knöchel bis zum Knie gesammelt, bis nur noch das Wadenbein und die Tibiaknochen übrig waren. (J) Hinterbein nach der Dissektion. (K) Quadrizeps wurde seziert. (L) Alle Skelettmuskeln, die für die posteriore mitochondriale Isolierung gesammelt wurden. Der Prozess wurde für beide Hinterbeine durchgeführt. Abkürzungen: TA = tibialis anterior; EDL = Extensor digitorum longus; GA = Gastrocnemius. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Reinheit des Fragmentierungsprozesses . (A) Allgemeines Proteinprofil mit Coomassie-Blau gefärbt. (B) Mitochondriales Proteinreinheitsprofil. (C) Nichtmitochondriale Marker. Die verschiedenen Fraktionen, die während der Mitochondrienisolierung erhalten wurden, wurden mit Antikörpern gegen verschiedene Proteine in spezifischen subzellulären Fraktionen beladen und inkubiert. Abkürzungen: Fraktion N = nicht homogenisiertes Gewebe und Kerne; SN1 = Überstandszahl 1: Zytoplasma + Organellen; SN2 = Überstand Nummer 2: Zytoplasma + Organellen; VDAC = spannungsabhängiger Anionenkanal; TOMM20 = Translokase der äußeren mitochondrialen Membran 20; mtTFA = mitochondrialer Transkriptionsfaktor A; TIMM23 = Translokase der inneren mitochondrialen Membran 23; LDHA = Laktatdehydrogenase A; HSP70 = Hitzeschockprotein 70; ER = endoplasmatisches Retikulum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. Bioenergetische Profilierung von Mitochondrien, isoliert aus Hinterbeinmuskeln einer 13 Monate alten männlichen Wildtyp-C57BL/6N-Maus. Die Injektionspunkte der verschiedenen Substrate und Inhibitoren sind in jedem Assay angegeben. Die Leistung der ETC- und OXPHOS-Maschinen kann mit Pyrutat und Malat oder Palmitoyl-L-Carnitin und Malat als Substrate im Kopplungsassay (A) bzw. β-Oxidation von FA-Assays (B) analysiert werden. (C) Der Elektronenflussassay ermöglicht die Untersuchung einzelner mitochondrialer Komplexe in Gegenwart von Pyruvat, Malat und FCCP; Pro Well wurden 10 μg Mitochondrien plattiert. Die Ergebnisse werden nach der Darstellungsoption für den mittleren Punkt angezeigt, um die Ergebnisse in aggregierter Form zu visualisieren. Dies steht im Gegensatz zur Punkt-zu-Punkt-Option, die die Visualisierung der 9 aufeinanderfolgenden Messungen ermöglichen würde, die normalerweise während jedes Messschritts durchgeführt werden. Die Art der Visualisierung kann nach Abschluss des Assays unter den Optionen des kinetischen Liniendiagramms in der Analysesoftware geändert werden. Abkürzungen: FA = Fettsäuren; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; RCR = Atemkontrollverhältnis; EFA = Elektronenfluss-Assay; BOX = β-Oxidation von FA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Kopplungsassay | ||||||
| Hafen | Inhibitor | [Lagerbestand] | [Einspritzanschluss] | [Finale] | Rezept | |
| Inhibieren | CAM-BSA | |||||
| Ein | ADP | 100 mM | 50 mM | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Elektronenfluss-Assay | ||||||
| Hafen | Inhibitor | [Lagerbestand] | [Einspritzanschluss] | [Finale] | Rezept | |
| Inhibieren | EFAM-BSA | |||||
| Ein | Rotenon | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinat | 500 mM | 100 mM | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimycin A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbat // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-Oxidations-Assay | ||||||
| Hafen | Inhibitor | [Lagerbestand] | [Einspritzanschluss] | [Finale] | Rezept | |
| Inhibieren | BOX-BSA | |||||
| Ein | ADP | 100 mM | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabelle 1: Herstellung von Inhibitorlösungen für die verschiedenen Assays. Die Spalte [Stock] zeigt die Konzentrationen der Stammlösungen der in der Spalte Inhibitor angegebenen Verbindung. [Injektionsanschluss ] bezieht sich auf die Konzentration der Inhibitorlösungen, die in die verschiedenen Anschlüsse der Kartusche geladen werden sollen, während die Spalte [Final] die endgültige Konzentration der Inhibitoren in den Vertiefungen angibt. Schließlich geben die Rezeptspalten die Volumina der Stamminhibitorlösungen und BSA-freien Medien an, die gemischt werden müssen, um die Lösungen vorzubereiten, die in die Injektionsanschlüsse geladen werden sollen. Abkürzungen: ADP = Adenosindiphosphat; FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; TMPD = N,N,N ′,N′-Tetramethyl-para-phenylen-diamin; Inhib = Inhibitor; BSA = Rinderserumalbumin; CAM-BSA = BSA-freies Kopplungsassaymedium; EFAM-BSA = BSA-free electron flow assay medium; BOX-BSA = BSA-freie β-Oxidation von Fettsäure-Assay-Medium.
| Hafen | Eingespeistes Volumen | Vorbereiteter Bestand (26 Bohrungen) |
| Ein | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabelle 2: Berechnung der Injektionsvolumina
| Aktion | Zeit (Minuten) | Wiederholung | Hafen |
| Kalibrieren | 15-20 | ||
| Warte | 10 | ||
| Mischen + Warten | 1 + 3 | × 2 | |
| Mischen | 1 | ||
| Messen + Mischen | 3 + 1 | × 2 | |
| Injizieren | Ein | ||
| Mischen | 1 | ||
| Messen | 3 | ||
| Mischen | 1 | ||
| Injizieren | B | ||
| Mischen | 1 | ||
| Messen | 3 | ||
| Mischen | 1 | ||
| Injizieren | C | ||
| Mischen | 1 | ||
| Messen | 3 | ||
| Mischen | 1 | ||
| Injizieren | D | ||
| Mischen + Messen | 1 + 3 | × 2 |
Tabelle 3: Protokolleinstellungen für die verschiedenen Assays
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Discussion
Alle Methoden, die zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, haben ihre Grenzen; Daher ist es entscheidend, die Methode auszuwählen, die am besten zu einer bestimmten experimentellen Fragestellung passt. Diese Arbeit bietet ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus, um verschiedene Atemassays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion durchzuführen. Tatsächlich ist die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in isolierten Mitochondrien unter Verwendung von Mikroplatten-basierten Technologien wertvoll, um die gewebespezifische Atmung in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Komplexität zu untersuchen. Darüber hinaus verleiht die Verwendung isolierter Mitochondrien die Kontrolle über die Substratverfügbarkeit und erleichtert das Verständnis der zugrunde liegenden biologischen Prozesse. Ein weiterer positiver Aspekt der Verwendung isolierter Mitochondrien ist, dass es möglich ist, den Zustand III zu untersuchen, da das nach der ADP-Injektion erzeugte ATP nicht wieder in neues ADP umgewandelt wird, da die meisten Transmembran-ATPasen verloren gehen. Darüber hinaus wird in den hier beschriebenen Assays Oligomycin hinzugefügt, um die potenzielle unspezifische ATP-Synthese zu blockieren20.
Für dieses Protokoll müssen einige wichtige Überlegungen hervorgehoben werden. Erstens sind isolierte Mitochondrien extrem empfindlich und sollten mit Vorsicht behandelt werden. Der hohe Gehalt an Saccharose und Mannit in den verwendeten Puffern sorgt für optimale osmotische Bedingungen, um die isolierten Mitochondrien vor Schäden zu schützen. Dennoch sollte die Assay-Dauer auf ein Minimum beschränkt werden, um die mitochondriale Lebensfähigkeit zu erhalten und eine Ablösung von der Mikrotiterplatte nach der Aussaat zu verhindern. Da daher Protokollschritte, wie die Herstellung von Assay-Medien und Substrat- und Inhibitorlösungen oder das Beladen der Inhibitoren in die respirometrische Assay-Kartusche, zeitaufwendig sind, sollte jeder Schritt perfekt koordiniert werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die auf enzymatischem Aufschluss21,24 und Mörser- und Stößelhomogenisierung17,19,21,23,24 basieren, beruht das hier beschriebene Verfahren auf der Verwendung eines automatisierten Homogenisators, der eine schnelle und effiziente Probenhomogenisierung ermöglicht. Wichtig ist, dass mitochondriale Suspensionen weniger empfindlich sind, wenn sie hochkonzentriert sind. Bereiten Sie daher Verdünnungen nur unmittelbar vor der Verwendung vor. Schließlich ist es wichtig, während des eigentlichen respirometrischen Assays schnell zu arbeiten. Normalerweise werden bei der Analyse von Zellen in Kultur in diesen Assays drei aufeinanderfolgende Messschritte nach der Injektion von Substraten oder Inhibitoren durchgeführt, was zu Protokollen führt, die sich zwischen 40 und 50 Minuten erstrecken. Um die Lebensfähigkeit der isolierten Mitochondrien während des gesamten Verfahrens zu gewährleisten, wird die Anzahl der Messschritte aufgrund ihrer Anfälligkeit häufig auf ein Minimum reduziert19, 23,25, wodurch die Zeit für die Durchführung der respirometrischen Analyse auf ~ 20 min reduziert wird. Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle (Tabelle 3) folgen diesem Trend, obwohl andere zuvor veröffentlichte Methoden effiziente OCR-Profile mit längeren und standardisierteren Messschritten melden26.
Wenn beispielsweise zwei aufeinanderfolgende Assays mit demselben Satz von Proben am selben Tag durchgeführt werden, bereiten Sie alle Reagenzien für den zweiten Assay während des ersten Assays mit Ausnahme der mitochondrialen Verdünnungen vor: Verdünnen, säen und spinnen Sie Mitochondrien unmittelbar vor Beginn des zweiten Assays, während das Instrument kalibriert wird. Nach Abschluss des Experiments muss der RCR-Parameter (Abschnitt 4, Schritt 1.7) berechnet werden, um die Qualität der verwendeten mitochondrialen Präparate zu beurteilen. Normalerweise zeigen RCR-Werte zwischen 3,5 und 5 an, dass die mitochondriale Integrität optimal ist und zeigen eine funktionell gekoppelte oxidative Atmung25. Assays mit niedrigeren RCR-Werten müssen verworfen werden, da die mitochondriale Integrität während der Isolierung beeinträchtigt wurde. Erwägen Sie in diesen Fällen, das mitochondriale Pellet zweimal zu waschen (Abschnitt 2, Schritte 19-21)22, wie bereits berichtet.
Zweitens ist die Aufrechterhaltung des korrekten pH-Wertes während des gesamten Verfahrens entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert aller Lösungen wie angegeben eingestellt ist, d. h. pH 7,2, und dass der pH-Wert immer mit KOH eingestellt wird, sofern nicht anders angegeben. Insbesondere sollte der pH-Wert von BSA-haltigen Puffern nicht direkt mit dem pH-Messgerät gemessen werden, da BSA die Sonde beschädigen kann. Stellen Sie daher den pH-Wert in den entsprechenden Puffern ein, bevor Sie BSA hinzufügen. Um Veränderungen des pH-Wertes durch BSA-Zusatz zu vermeiden, verwenden Sie immer FFA BSA. Darüber hinaus könnten einige ultrareine H2O-Chargen sauer sein, so dass die Verwendung von kommerziell gereinigtem pH-Wert 7 H2O empfohlen wird. Darüber hinaus muss sichergestellt werden, dass das pH-Messgerät korrekt kalibriert ist und dass es das geeignete Modell ist, um den pH-Wert der herzustellenden Chemikalien zu messen.
Drittens ist es entscheidend, den Probenentnahmeschritt zur Proteinmessung der endgültigen mitochondrialen Suspension (Abschnitt 2, Schritt 21) korrekt durchzuführen, um eine mitochondriale Zerstörung zu verhindern. Schwebe das Pellet schnell, aber gründlich aus, sammle ein Aliquot und füge FFA BSA zur verbleibenden Suspension hinzu, um das osmotische Gleichgewicht zu erhalten und die Mitochondrien vor Schäden zu schützen. Wenn FFA BSA bereits im Resuspensionspuffer vorhanden wäre und somit während der Proteinquantifizierung, würde der hohe Proteingehalt die Quantifizierungsergebnisse verwirren. Aus diesem Grund muss FFA BSA hinzugefügt werden, nachdem ein Aliquot für die Quantifizierung beiseite gelegt wurde.
Viertens ist diese Methode sehr vielseitig und kann an die Bedürfnisse des Experimentators angepasst werden. Wenn beispielsweise das untersuchte Tiermodell durch reduzierte Muskelmasse gekennzeichnet ist (z. B. sarkopenische Mäuse), können zusätzliche Muskeln die mitochondriale Ausbeute erhöhen. Obwohl bei dieser Arbeit eine erwachsene männliche C57BL / 6N-Maus mit ausgewachsenem Wildtyp verwendet wurde, können stattdessen Tiere jeden Geschlechts, Alters oder genetischen Hintergrunds sowie bestimmte Muskeltypen eingesetzt werden.
Fünftens können sich die Atemwerte zwischen den Experimenten aufgrund leichter Schwankungen in der Zusammensetzung von Puffern und Reagenzien unterscheiden, die jedes Mal frisch zubereitet werden müssen. Alter, Geschlecht, genetischer Hintergrund oder Umweltbedingungen können ebenfalls einen tiefgreifenden Einfluss auf die Ergebnisse haben. Ein erfolgreiches Experiment sollte jedoch einen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs nach der Injektion komplexer Substrate wie ADP und Succinat, eine Abnahme nach der Injektion von Inhibitoren wie Oligomycin oder Rotenon und eine deutliche Zunahme aufweisen, wenn der potente Entkoppler FCCP hinzugefügt wird. Um eine hohe technische Variabilität zu vermeiden, sollten außerdem eine gründliche Resuspension von mitochondrialen Pellets sichergestellt werden, um homogene Suspensionen zu erhalten, bevor sie in die Mikrotiterplatte ausgesät werden.
Sechstens, wenn die basalen Atemwerte niedrig sind, sollten Sie ein Titrationsexperiment durchführen, um die Proteinmenge für die Aussaat anzupassen. Da diese Arbeit schließlich eine Methode zur Gewinnung von rohen mitochondrialen Extrakten bietet, wird ein bestimmter Grad an Verunreinigung erwartet, der mit anderen Organellen, hauptsächlich ER, verbunden ist. Ein aggressiverer Fragmentierungsprozess zur Entfernung dieser Verunreinigungen wäre schädlich für die mitochondriale Lebensfähigkeit und würde die Durchführung von Atemwegstests behindern. Wenn die Reinheit ein Problem darstellt, insbesondere wenn sie zwischen den Proben nicht konsistent ist, können die Assay-Ergebnisse relativ zur mitochondrialen Reinheit normalisiert werden, nachdem Western Blots gegen verschiedene Organellenmarker ausgeführt wurden (Abbildung 3). Unseres Wissens ist dies die erste Methode, die Bedenken hinsichtlich der mitochondrialen Reinheit in Rohextrakten hervorhebt. Normalerweise wird in anderen Protokollen für respirometrische Assays mit isolierten Mitochondrien die gleiche Menge Proteinextrakt in den Vertiefungen ausgesät, um Proben zu vergleichen, vorausgesetzt, dass in allen Fällen die gleiche Menge an Mitochondrien verwendet wird. Dies ist eine vernünftige Annahme, wenn man bedenkt, dass die Isolierung in allen Stichproben parallel durchgeführt wird. Der genetische oder umweltbedingte Hintergrund der untersuchten Proben kann jedoch zu erheblichen Unterschieden in der Reinheit der mitochondrialen Extrakte führen. Zum Beispiel, wenn eine bestimmte genetische Mutation eine erhöhte Entwicklung von zytoplasmatischem ER verursacht, könnten rohe mitochondriale Extrakte aus diesen Tieren einen höheren ER-Gehalt als erwartet und folglich weniger als erwartetes mitochondriales Protein enthalten. Selbst wenn also die gleiche Menge an Gesamtprotein aus Kontroll- und Mutantenproben in der Mikrotiterplatte ausgesät wird, würde der Sauerstoffverbrauch der Mutanten unterschätzt. Daher wird empfohlen, die Reinheit der Extrakte aller untersuchten Bedingungen zu bestimmen. Wenn die Werte vergleichbar sind, ist keine Normalisierung erforderlich. Wenn sich die Reinheitswerte zwischen den Proben jedoch erheblich über den statistischen Fehler hinaus unterscheiden, den der Experimentator bereit ist zu akzeptieren, sollten sie zur Normalisierung der Sauerstoffverbrauchsergebnisse verwendet werden.
Das vorliegende Protokoll weist einige Einschränkungen auf. Bemerkenswert ist, dass diese Methode für Skelettmuskelgewebe optimiert wurde, das von Mäusen isoliert wurde. Anpassungen müssen möglicherweise vorgenommen werden, wenn unterschiedliche Gewebe oder Skelettmuskeln verschiedener Spezies verwendet werden. Wenn Analysen an isolierten Mitochondrien durchgeführt werden, geht die normale zelluläre Mikroumgebung aufgrund des Fehlens des zellulären Kontextes und der anderen Organellen, die mit Mitochondrien interagieren könnten, verloren. Dies könnte zu Ergebnissen führen, die leicht von den physiologischen Bedingungen abweichen. Schließlich, wenn die Mitochondrien zentrifugiert werden, haften sie am Boden der Vertiefungen. Obwohl dies absolut notwendig ist, sind die möglichen Auswirkungen der Zentrifugation auf ihren Normalzustand unbekannt.
Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass nach der Durchführung der respirometrischen Assay-Analysen eine Verringerung des Sauerstoffverbrauchs im Zusammenhang mit der ATP-gebundenen oder FCCP-stimulierten Atmung in isolierten Mitochondrien auf mögliche mitochondriale Veränderungen hinweisen könnte, die erklärt werden könnten durch20: 1) eingeschränkter Transport von Substraten durch die innere mitochondriale Membran, 2) verminderte Aktivität der Enzyme, die an den geschwindigkeitsbegrenzenden Reaktionen spezifischer Stoffwechselwege beteiligt sind, wie z.B. die ETC, Krebs-Zyklus oder β-Oxidation oder 3) beeinträchtigte ETC-Funktion, neben anderen möglichen Erklärungen.
Zusammenfassend stellt die hier beschriebene aktualisierte Methode eine adäquate und zuverlässige Methode zur Beurteilung der ETC- und OXPHOS-Funktion aus Skelettmuskelgewebe dar. Es hat mehrere Anwendungen, um zu bewerten, wie genetische Veränderungen oder die Umwelt die mitochondriale Atmung beeinflussen könnten, die zu einem bestimmten Phänotyp beiträgt. Bemerkenswerterweise könnte das vorliegende Protokoll an andere Modellorganismen angepasst oder mit menschlichen Proben verwendet werden, um mögliche mitochondriale Funktionsstörungen im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.
Acknowledgments
Wir danken Juan J. Tena für den Einsatz des Homogenisators und der CABD Proteomics and Animal Husbandry Einrichtungen für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Bildung, Kultur und Sport durch ein Stipendium FPU16/03264 an J.D.H.C., die Association Française contre les Myopathies (AFM) durch Fellowship Grant #22450 an C.V.-G., ein Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) und BFU2017-83150-P an J.J.C unterstützt. Der Junta de Andalucía-Zuschuss P18-RT-4572, das RENDER-Förderprogramm der Europäischen Union und das spanische Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten gewähren RED2018-102576-T an P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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