Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Abstract

Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.

Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.

Introduction

Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse¹. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR², was zu seiner Autophosphorylierung³ und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IR....

Protocol

Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt.

1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus

1. 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO₂ -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung.
   Anmerkungen: Isolieren Sie nach der Euthanasie von Nagetieren sofort das Fettgewebe und führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube du....

Results

Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (

Discussion

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können²⁶. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyten kommen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolierung von Maus-Adipozyten-VorläuferzellenACK-Lysingpuffer
	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Mikrokügelchen	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basalmembranmatrix (Matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Wachstumsfaktor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoklonaler Antikörper (30-F11) - Biotin	eBioscience	13-0451-85
Kollagenase, Typ 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethason	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM Low Glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Wachstumsfaktor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS-Mix	Sigma	I3146
L-Ascorbinsäure 2-phosphat	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Wachstumsfaktor
Linolsäure-Albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 Medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Wachstumsfaktor
Penicilin-Streptomycin	BioWest	L0022-100
Vorabscheidefilter (70 & Mikro; m)	Miltenyi	130-095-823
Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipozytendifferenzierung und Induktion der Insulinresistenz
3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX]	Sigma	I5879	Differenzierungscocktail
BMP4	R& D Systems	5020-BP-010	Differenzierungscocktail
Dexamethason	Sigma	D1756	Differenzierungscocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazon	Cayman	71742	Differenzierungscocktail
TNFα	Forschung & Forschung D Systems	210-TA-005
3. Bewertung des Insulin-Signalwegs mittels Western Blot
	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli Puffer
Glycin Sigma		G7126	Lauf- und Transferpuffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA Puffer
2- Mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli Puffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer Puffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA Puffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA Puffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA Puffer
Nitrozellulosemembran	BioRad	1620112
Fettfreie Trockenmilch	BioRad	1706404	Blockierungslösung
Vorgefärbtes Protein Standard	BioRad	1610395
Proteasehemmer Cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho-Insulinrezeptor Β	Zellsignalisierung	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antikörper	Zellsignalisierung	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) Antikörper	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA-Puffer
SDS	BioRad	1610302	Lauf- und Laemmli-Puffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Lauf-, Transfer- und Laemmli-Puffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA-Puffer - TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T