Die Kombination von Laser-Capture-Mikrodissektion und mikrofluidischer RT-qPCR bietet anatomische und biotechnische Spezifität bei der Messung des Transkriptoms in einzelnen Neuronen und Glia. Die Anwendung kreativer Methoden mit dem systembiologischen Ansatz auf psychiatrische Erkrankungen kann zu Durchbrüchen im Verständnis und in der Behandlung führen, wie z.B. die Neuroinflammation-Anti-Belohnungs-Hypothese bei Sucht.
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Methodenartikel
Untersuchung von Treibern von Anti-Belohnung im Suchtverhalten mit anatomisch spezifischen Einzelzell-Genexpressionsmethoden
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Steigende Raten von Suchtverhalten haben Forscher für psychische Gesundheit und Kliniker gleichermaßen motiviert, Antibelohnung und Genesung zu verstehen. Diese Abkehr von Belohnung und Beginn erfordert neue Perspektiven, Paradigmen und Hypothesen sowie eine Erweiterung der Methoden zur Untersuchung von Sucht. Hier geben wir ein Beispiel: Ein systembiologischer Ansatz zur Untersuchung von Antibelohnung, der Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) und Hochdurchsatz-Mikrofluidik-Reverse-Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) kombiniert. Die Netzwerkdynamik der Genexpression wurde gemessen und ein Schlüsselfaktor für neuroviszerale Dysregulation beim Alkohol- und Opioidentzug, die Neuroinflammation, identifiziert. Diese Kombination von Technologien bietet anatomische und phänotypische Spezifität bei Einzelzellauflösung mit hoher Durchsatzsensitivität und spezifischen Genexpressionsmessungen, die sowohl hypothesengenerierende Datensätze als auch mechanistische Möglichkeiten liefern, die Möglichkeiten für neue Erkenntnisse und Behandlungen schaffen.
Einleitung
Sucht bleibt eine wachsende Herausforderung in den Industrieländern 1,2. Trotz großer wissenschaftlicher und klinischer Fortschritte steigen die Suchtraten weiter an, während die Wirksamkeit etablierter Behandlungen bestenfalls stabil bleibt 3,4,5. Fortschritte in der Biotechnologie und wissenschaftliche Ansätze haben jedoch zu neuen Methoden und Hypothesen geführt, um die Pathophysiologie der Substanzabhängigkeit weiter zu untersuchen 6,7,8<....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University IACUC genehmigt.
1. Tiermodell
- Hausrüde Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) Rattendrillinge einzeln mit freiem Zugang zu Ethanol-Chow (2 Ratten) oder Kontroll-Chow-Mischung (1 Ratte).
ANMERKUNG: Dieses repräsentative Experiment verwendete das Lieber-DeCarli-Protokoll, um die Neurobiologie des Alkoholentzugs zu untersuchen25,26. Rattend....
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Ergebnisse
Die Validierung der Einzelzellentnahme erfolgt visuell während der LCM-Verfahren. Zellkerne werden an der QC-Station untersucht. Der Zelltyp kann durch Emission von markiertem Fluorophor für diesen Zelltyp und seine allgemeine Morphologie bestimmt werden. Wurden auf der Kappe nicht erwünschte Zellen selektiert, kann deren Erbgut mit einem UV-Laser an der QC-Station zerstört werden. Eine weitere Validierung durch molekulare Analyse ist ebenfalls erforderlich. In diesem repräsentativen Beispiel16 wu.......
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Diskussion
Alkoholkonsumstörung bleibt eine herausfordernde Krankheit zu behandeln. Unsere Gruppe hat sich dieser Störung genähert, indem sie Anti-Belohnungsprozesse aus einer systemneurowissenschaftlichen Perspektive untersucht hat. Wir haben Genexpressionsveränderungen in einzelnen NTS-Neuronen und Mikroglia in einer Alkoholentzugszeitreihe16 gemessen. Das NTS wurde aufgrund seiner herausragenden Rolle bei der autonomen Dysregulation ausgewählt, die beim Alkoholentzugssyndrom auftritt. Wir kombinieren LCM .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die hier vorgestellte Arbeit wurde durch NIH HLB U01 HL133360 für JS und RV, NIDA R21 DA036372 für JS und EVB, T32 AA-007463 für Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S und National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20X DNA-Bindungsfarbstoff | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagenz | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamisches Array IFC für die Genexpression (im Text als qPCR-Chip bezeichnet) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-CD11β Antikörper | Genway Biotech | CCEC48 | Mikroglia-Färbung |
| Anti-NeuN-Antikörper, Klon A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronale Färbung |
| Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper | abcam | ab112 | Färbung für TH+-Neuronen |
| ArcturusXT Laser Capture Mikrodissektionssystem | Arcturus | NA | |
| NA Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR Plattform |
| Rinderserum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis Pufferlösungskomponenten |
| CellsDirect Resuspension & Lysepuffer | Kit ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nukleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) ReadyProbe Sekundärer Antikörper, Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) ReadyProbe Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry |
| Antikörper-Exonuklease I | Neu Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | |
| NA ExtracSure Probenextraktionsgerät | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Objektträger | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Objektträger aus Normalglas |
| GeneAmp Dünnwandiges Reaktionsröhrchen | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Ziege Anti-Maus IgG (H+L), Superclona Rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antikörper |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | |
| NA RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Enthält VILO und SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher | Scientific 4391128 | NA |
| TE Puffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate 96-Well-PCR-Platte mit Semi-Rand, 0,2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Referenzen
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence.
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Nachdrucke und Genehmigungen
