접촉 과민증 (CHS)은 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 뮤린 실험 모델입니다. CHS는 가슴과 복부의 면도 된 피부를 페인팅하여 반응성 합텐으로 감작을 기반으로하며, 희석 된 합텐으로 후속 귀 피부 챌린지를 통해 다양한 방법으로 평가되는 붓기 반응을 일으 킵니다.
접촉 과민증 (CHS)은 마우스에서 연구 할 수있는 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 실험 모델입니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 제시하는 것을 목표로합니다. CHS를 유도하기 위해, “0”일째에, 마우스는 아세톤-에탄올 혼합물 중의 합텐 2,4,6-트리니트로클로로벤젠(TNCB)으로 복 도장에 의해 이전에 면도된 반점에 감작시킨 반면, 음성 대조군 마우스는 비히클 단독-아세톤-에탄올 혼합물로 가짜 감작되었다. “4”일째에, 기준선 귀 두께를 CHS(챌린지)의 도출 전에 시험군 및 대조군 둘 다에서 희석된 TNCB로 양쪽 귀를 페인팅함으로써 마이크로미터로 측정하였다. 24시간 후, 귀 팽윤을 마이크로미터로 측정하였다. CHS는 염증이 있는 조직에서 팽윤을 일으키는 T 세포 매개 면역 반응의 예이며, 동일한 합텐으로 피부 챌린지 후 24시간 후에 최고조에 달한다. 귀 부종의 증가는 증강 된 귀 무게, 골수퍼옥시다제 (MPO) 활성, 귀 추출물의 전염증성 사이토카인 농도, 조직 학적 검사에서 부종 진피의 두꺼움 증가 및 귀 혈관 투과성과 관련이 있습니다. 또한 대조군 마우스와 비교했을 때 시험군의 혈청에서 TNP 특이적 IgG1 항체의 농도가 증가하였다. 추가적으로, CHS는 이전에 TNCB로 감작된 공여자로부터 수득된 CHS-이펙터 세포와 함께 성공적으로 전달될 수 있다. CHS-이펙터 세포를 순진한 수용자 마우스에 정맥내 투여하였고, 이는 후속적으로 동일한 희석된 합텐으로 도전되었다. 귀 부종은 24시간 후에 마이크로미터로 측정하였다.
알러지성 접촉성 피부염(ACD)은 합텐(haptens)이라고 불리는 저분자량 화학물질에 노출되어 발생하는 IV형 과민반응으로 인한 선진국에서 흔히 나타나는 피부 염증성 질환이다. 인간에서 접촉 감작을 일으키는 물질에는 화장품에 존재하는 중금속 이온 (크롬, 니켈, 철, 코발트), 테레빈 유, 향료, 염료 및 방부제 (예 : 파라페닐렌디아민), 일부 약물 (예 : 네오 마이신, 벤조카인), β-락탐 항생제 (즉, 페니실린), 식물에 의해 생성 된 화학 물질 (펜타 데카카테콜, 옻 아이비에 존재하는 물질) 및 사진 산업에서 사용되는 하이드로 퀴논 1,2 . ACD 병인학은 산업에서만 100,000 개 이상의 화학 물질이 사용되고 매년 2,000 개의 새로운 화학 물질이 합성되므로 매우 높습니다. 현재까지 접촉 합텐 / 알레르겐 일 수있는 3,700 개 이상의 분자가 확인되었습니다3. 접촉 과민 반응 (CHS)은 마우스, 기니아 피그 및 래트에서 연구 할 수있는 ACD의 실험 모델이며 유기 용매 4,5,6에 용해 된 반응성 화학 합텐의 국소 피부 적용에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.
CHS는 감작(유도) 및 이펙터(챌린지) 단계로 구성됩니다. 동물 모델에서 합텐은 먼저 신체의 단백질에 공유적으로 결합하여 신 항원을 만듭니다. 감작 단계 동안, 활성화된 각질세포는 전염증성 사이토카인-종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 인터루킨 1β(IL-1β)7을 생성함으로써 피부 수지상 세포(sDCs)의 이동 및 성숙을 촉진한다. 표피 랑게르한스 세포 (LCs)는 CHS 유도 및 이펙터 단계8 동안 항원을 존재한다. 감작 동안 합텐에 노출된 LCs는 조절 및 이펙터 세포 둘 다의 유도를 촉진한다(9). 여러 연구로부터의 증가하는 증거는 CHS 반응이 CD4+ MHC 클래스 II 제한 Th1 세포 중 어느 하나에 의해 매개될 수 있고, 특징적인 염증 침윤물을 채용하기 위해 인터페론 γ(IFN-γ)을 국부적으로 방출할 수 있고, IFN-γ을 방출할 수 있지만 대부분 각질세포에 대한 세포독성 손상을 매개할 수 있는 CD8+ MHC 클래스 I-제한 Tc1 림프구, 그리고 현재 또한 인터루킨 17(IL-17)-생산 Th17 세포(10), 11.
다양한 종 12,13,14 및 합텐을 채용하는 몇몇 상이한 CHS 모델이 개발되었다 (상이한 합텐, 용매 및 적용 시간의 상세한 비교는 표 1에 요약된다). 자주 사용되는 실험실 종 인 마우스는 CHS를 연구 할 때 몇 가지 이점을 제공합니다. 다른 종에 비해 마우스들 사이에서 더 많은 균주, 녹아웃 (KO) 및 트랜스제닉 동물이 있으며, 이는 이들을 매우 매력적인 동물로 만든다15. 또한, CHS 모델은 많은 동물을 필요로하며, 마우스는 여기에서 더 경제적입니다. 동물 모델은 모든 측면에서 ACD를 모방하지 않으며; 특히, 그들은 인간에게 흔하지 않은 딱딱함과 절망을 보여줍니다16,17. 만성 질환의 특징은 주로 기술된 모델이 장기간 동안 합텐의 적용을 가정하지 않기 때문에 재현하기가 어렵다. 그러나, ACD의 많은 중요한 측면들이 재현된다는 것이 여기에서 확인되었다. 또한 인간과 마찬가지로 이러한 특징은 국소 알레르기 반응과 관련이 있음이 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 설명 된 합텐, 용매 및 그 적용의 선택은 결과가 수많은 시험관 내 테스트에 의해 확인되었으며 현재 버전이 확립 될 때까지 수년 동안 실험실에서 테스트되고 수정되었다는 사실에 의해 결정되었습니다. 뮤린 모델은 ACD의 발달에 관여하는 세포 서브셋 또는 사이토카인의 분석을 허용하며 새로운 치료법의 전임상 평가에 필수적이다.
CHS는 합텐을 통해 유도되며, 이는 피부의 자체 단백질 항원에 결합하여 신 항원을 생성합니다. CHS는 순환 항원 특이적 CHS-이펙터 T 세포의 국소 혈관외 모집에 의해 매개되며, 이는 도전된 조직에서 팽윤을 초래하고, 동일한 합텐6에 이차 피부의 노출 후 24 h를 피크로 한다. 조직의 팽윤은 주로 백혈구 및 백혈구 의존성 피브린 침착(24)의 침윤에 의해 야기?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 서브벤션 SUBZ에 의해 뒷받침되었다. 폴란드 브로츠와프에있는 의과 대학의 A020.22.060 및 과학 고등 교육부 N N401 545940에서 MS 및 IP2012 0443 72에 대한 보조금으로 MMS에.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |