Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques
Summary
Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.
Abstract
Un nombre croissant de preuves montre que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et de l’adaptation myocardique aux blessures. Cependant, la littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Il a été rapporté que les cellules B étaient à la fois parmi les cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs ou qu’elles étaient présentes, mais à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes, ou qu’elles étaient assez rares. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de cellules B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de cellules B du myocarde lésé. La mise en œuvre d’une méthode partagée et reproductible pour évaluer la prévalence des lymphocytes B myocardiques est essentielle pour harmoniser les observations des différents groupes de recherche et ainsi favoriser l’avancement de l’étude des interactions myocardiques des lymphocytes B. D’après notre expérience, les observations apparemment contrastées rapportées dans la littérature proviennent probablement du fait que les cellules B myocardiques murines sont principalement intravasculaires et connectées à l’endothélium microvasculaire. Par conséquent, le nombre de cellules B récupérées dans un cœur murin est extrêmement sensible aux conditions de perfusion utilisées pour nettoyer l’organe et à la méthode de digestion utilisée. Nous rapportons ici un protocole optimisé qui tient compte de ces deux variables critiques d’une manière spécifique. Ce protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux du nombre de cellules B myocardiques murines et permet aux chercheurs de distinguer les cellules B myocardiques extravasculaires des cellules B intravasculaires.
Introduction
Les lymphocytes B sont des cellules immunitaires hautement spécialisées qui jouent un rôle important dans les réponses immunitaires adaptatives et innées1. Il existe deux populations principales de cellules B : une plus petite population de cellules B1 qui sont principalement produites au cours de la vie embryonnaire, et une population prépondérante de cellules B2 qui sont produites à l’âge adulte dans la moelle osseuse1. Après avoir mûri dans la moelle osseuse, les cellules B migrent vers les organes lymphoïdes primaires et secondaires. De là, ils recirculent continuellement entre les organes lymphoïdes voyageant à travers les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques2. Les cellules B expriment des anticorps spécifiques à leur surface, qui fonctionnent comme des récepteurs. Lorsque les cellules B rencontrent un antigène qui se lie à leur récepteur, un signal d’activation peut être déclenché. Les lymphocytes B activés migrent vers le tissu où l’antigène a été trouvé ou retournent dans la moelle osseuse où ils peuvent devenir des plasmocytes producteurs d’anticorps 3,4.
Récemment, il a été reconnu que le cœur abrite une population importante de cellules B. Des études chez les rongeurs ont montré que les lymphocytes B colonisent le cœur au début du développement embryonnaire5, et que les lymphocytes B associés au myocarde sont pour la plupart intravasculaires, des cellules B2 naïves adhérant à l’endothélium6,7, avec un faible pourcentagede cellules B17. Il existe encore de nombreuses zones d’incertitude, mais les données disponibles indiquent que les cellules B jouent un rôle important à la fois dans le cœur naïf et dans le contexte de l’adaptation myocardique aux blessures.
Des études sur le cœur murin naïf ont montré qu’au départ, les cellules B myocardiques sont principalement situées dans l’espace intravasculaire, adhèrent à l’endothélium (>95% des cellules B cardiaques murines se sont avérées être situées dans l’espace intravasculaire). On a constaté que ces cellules B avaient des schémas d’expression génique différents de ceux des cellules B circulantes isolées du sang périphérique. L’analyse des cœurs naïfs d’animaux déficients en lymphocytes B et de témoins syngéniques a révélé que les animaux dépourvus de lymphocytes B avaient des cœurs plus petits et une fraction d’éjection6 plus élevée. Toutes ces preuves suggèrent que les cellules B pourraient moduler la croissance myocardique et / ou la fonction myocardique, et que non seulement les cellules B interstitielles mais aussi intravasculaires pourraient être responsables de ces observations. Les cellules B ont également été trouvées pour moduler le phénotype des macrophages résidents du myocarde8.
Plusieurs études ont montré que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de l’adaptation myocardique aux lésions 8,9,10,11,12,13. Les lymphocytes B s’accumulent transitoirement dans le cœur blessé, probablement par un mécanisme dépendant de CXCL13-CXCR511,13. À partir de là, les cellules B favorisent le remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes, dont le recrutement demonocytes médiés par les cytokines 9,12. En outre, les cellules B peuvent produire des anticorps contre les protéines cardiaques qui peuvent favoriser l’extension des lésions cardiaques et du remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Les cellules B peuvent également exercer des effets protecteurs sur le cœur blessé par la sécrétion d’IL-1010.
Alors que le nombre de groupes étudiant le rôle des cellules B dans le cœur naïf et blessé augmente, il devient de plus en plus important de définir des protocoles partagés pour quantifier et évaluer correctement les cellules B myocardiques et ainsi éviter les incohérences qui ont déjà commencé à apparaître dans la littérature. Jusqu’à présent, les cellules B ont en fait été signalées comme étant l’une des cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs7 et présentes à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes26,27, ou assez rares 28. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de lymphocytes B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë 7,9,13, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de lymphocytes B du myocarde29 lésé. Les études sur les cellules immunitaires cardiaques donnent rarement des détails sur les conditions de perfusion et il n’y a pas de consensus sur les conditions de digestion. Étant donné que dans le cœur de rongeur, une grande proportion de cellules B sont intravasculaires et que l’extraction des cellules immunitaires du myocarde dépend fortement de la méthode de digestion utilisée, les différences rapportées dans la littérature pourraient être le résultat de différences dans la perfusion d’organes et la digestion tissulaire.
Présenté ici est une méthode détaillée pour la quantification basée sur la cytométrie de flux des cellules B myocardiques murines qui maximise le rendement de la récupération des cellules B en optimisant les conditions de perfusion et de digestion et permet la discrimination des cellules B myocardiques intravasculaires vs extravasculaires6. Ce protocole est une adaptation et une optimisation d’autres protocoles similaires qui distinguent les cellules immunitaires intravasculaires et interstitielles 28,30,31.
Dans ce protocole, nous normalisons la perfusion myocardique pour éliminer les cellules B flottant dans l’espace intravasculaire sans éliminer les cellules B biologiquement pertinentes adhérant à l’endothélium microvasculaire. De plus, en nous appuyant sur des protocoles antérieurs qui ont décrit l’utilisation de l’injection intraveineuse d’anticorps pour distinguer les cellules immunitaires intravasculaires des cellules immunitaires interstitielles32, et en tirant parti du fait que les cellules B expriment le marqueur de surface B22033, nous démontrons comment distinguer les cellules B myocardiques intravasculaires des cellules B extravasculaires par injection intravasculaire d’un anticorps spécifique B220 immédiatement avant le sacrifice animal et la perfusion cardiaque. Ce protocole est pertinent pour la recherche de tout scientifique intéressé à inclure l’analyse des cellules B myocardiques dans le cœur naïf et blessé. La mise en œuvre généralisée de ce protocole réduira les incohérences entre les groupes de recherche, permettra l’analyse des changements dans les pools de lymphocytes B myocardiques intravasculaires et extravasculaires, et renforcera ainsi l’avancement des découvertes dans le domaine de l’immunologie cardiaque.
En résumé, le protocole représente un flux de travail optimisé pour quantifier et analyser les cellules B myocardiques via la cytométrie en flux, tout en distinguant les cellules situées dans l’espace extravasculaire et l’espace intravasculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un nombre croissant de preuves indique que les cellules B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et du remodelage/adaptation myocardique aux blessures 7,8,9,10,11,12,13,36. La cytométrie en flux est un excellent outil pour…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par les subventions NHLBI 5K08HLO145108-03 et 1R01HL160716-01 accordées à Luigi Adamo.
Le cytomètre en flux Aurora utilisé pour développer cette étude a été financé par la subvention NIH S10OD026859. Nous reconnaissons le soutien du JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
Referenzen
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