Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus
Summary
São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.
Abstract
Além de formar uma barreira de alta resistência, o urotélio que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal é hipotetizado para detectar e transmitir informações sobre seu ambiente aos tecidos subjacentes, promovendo a função e o comportamento miccional. A ruptura da barreira urotelial, ou sua função sensorial/transdutor, pode levar à doença. O estudo desses eventos complexos é dificultado pela falta de estratégias simples para alterar a expressão gênica e proteica no urotélio. São descritos métodos que permitem aos investigadores gerar grandes quantidades de adenovírus de alto título, que podem então ser usados para transduzir urotélio de roedores com alta eficiência e de maneira relativamente simples. Tanto cDNAs quanto pequenos RNAs interferentes podem ser expressos usando transdução adenoviral, e o impacto da expressão de transgênicos na função urotelial pode ser avaliado 12 h a vários dias depois. Estes métodos têm ampla aplicabilidade em estudos de biologia urotelial normal e anormal utilizando modelos animais de camundongos ou ratos.
Introduction
O urotélio é o epitélio especializado que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal1. É composto por três estratos: uma camada de células guarda-chuva altamente diferenciadas e polarizadas, muitas vezes binucleadas, cujas superfícies apicais são banhadas por urina; uma camada celular intermediária com uma população de células binucleadas de amplificação de trânsito que pode dar origem a células guarda-chuva superficiais em resposta à sua perda aguda; e uma única camada de células basais, cujo subconjunto funciona como células-tronco que podem regenerar a totalidade do urotélio em resposta à lesão crônica. As células-guarda-chuva são as principais responsáveis pela formação da barreira urotelial de alta resistência, cujos componentes incluem uma membrana apical (rica em colesterol e cerebrosídeos) com baixa permeabilidade à água e solutos, e um complexo juncional apical de alta resistência (composto por tight junctions, junções aderentes, desmossomos e um anel de actomiosina associado)1 . Tanto a superfície apical da célula guarda-chuva quanto seu anel juncional expandem-se durante o enchimento vesical e retornam ao seu estado pré-preenchido rapidamente após a micção 1,2,3,4,5. Além de seu papel na função de barreira, o urotélio também tem funções sensoriais e transdutores que lhe permitem detectar mudanças no meio extracelular (por exemplo, estiramento) e transmitir essa informação por meio da liberação de mediadores (incluindo ATP, adenosina e acetilcolina) para os tecidos subjacentes, incluindo processos nervosos aferentes suburoteliais 6,7,8 . Evidências recentes desse papel são encontradas em camundongos sem expressão urotelial de Piezo1 e Piezo2, o que resulta em alteração da função miccional9. Além disso, ratos superexpressando a proteína formadora de poros de tight-junction CLDN2 na camada de células guarda-chuva desenvolvem inflamação e dor análogas àquelas observadas em pacientes com cistite intersticial10. Hipotetiza-se que a interrupção da função sensorial/transdutor ou barreira urotelial possa contribuir para vários distúrbios vesicais 6,11.
Uma melhor compreensão da biologia do urotélio em estados normais e patológicos depende da disponibilidade de ferramentas que permitam aos investigadores prontamente desregular a expressão gênica endógena ou permitir a expressão de transgenes no tecido nativo. Enquanto uma abordagem para downregulate da expressão gênica é gerar camundongos knockout uroteliais condicionais, essa abordagem depende da disponibilidade de camundongos com alelos floxed, é trabalhosa e pode levar meses a anos para completar12. Não surpreendentemente, então, os pesquisadores desenvolveram técnicas para transfectar ou transduzir o urotélio, o que pode levar a resultados em uma escala de tempo mais curta. Os métodos publicados para transfecção incluem o uso de lipídios catiônicos13, oligodesoxinucleotídeos fosforotiotados anti-senso 14 ou ácidos nucleicos antisenso ligados à proteína TAT do HIV penetrando no peptídeo 11-mer15. No entanto, o foco deste protocolo é no uso da transdução mediada por adenovírus, uma metodologia bem estudada que é eficiente na entrega do gene a uma ampla gama de pilhas, foi testada em numerosos ensaios clínicos, e mais recentemente foi usada para entregar o cDNA que codifica a proteína do capsídeo COVID-19 aos receptores de uma variante da vacina COVID-1916, 17º. Para uma descrição mais completa do ciclo de vida dos adenovírus, vetores adenovirais e aplicações clínicas dos adenovírus, o leitor é direcionado para a referência17.
Um marco importante no uso de adenovírus para transduzir o urotélio foi o relato de Ramesh e col. que mostrou pré-tratamentos curtos com detergentes, incluindo N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) que aumentaram drasticamente a transdução do urotélio por um adenovírus que codifica a β-galactosidase18. Usando este estudo de prova de princípio como guia, a transdução mediada por adenovírus do urotélio tem sido agora usada para expressar uma variedade de proteínas, incluindo GTPases da família Rab, fatores de troca de guanina-nucleotídeos, fragmentos motores de miosina, claudinas associadas à junção apertada formadora de poros e ADAM17 10,19,20,21,22 . A mesma abordagem foi adaptada para expressar pequenos RNAs interferentes (siRNA), cujos efeitos foram resgatados pela co-expressão de variantes resistentes a siRNA do transgene22. O protocolo aqui descrito inclui métodos gerais para gerar grandes quantidades de adenovírus altamente concentrados, uma exigência para essas técnicas, bem como adaptações dos métodos de Ramesh et al.18 para expressar transgenes no urotélio com alta eficiência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto Ramesh e col. estavam focados no desenvolvimento de estratégias para o uso da transdução adenoviral no tratamento do câncer de bexiga18, relatos mais recentes demonstraram a utilidade dessas técnicas no estudo da biologia/fisiologia e fisiopatologia urotelial normal 10,18,19,20,21 . As características importantes dessa ab…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um prêmio de projeto piloto através de P30DK079307 (para M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (para G.A. e M.D.C.), NIH grant R01DK129473 (para G.A.), um prêmio American Urology Association Career Development e um grant Winters Foundation (para N.M.), pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e pelo S10OD028596 (para G.A.), que financiou a compra do sistema confocal utilizado para capturar algumas das imagens apresentadas neste manuscrito.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Referenzen
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
