Summary
يجمع البروتوكول الحالي بين التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح الخلايا التائية متعددة الوظائف (TPF) في خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) داخل الأطفال الملقحين بفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV). تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFs الخاصة ب JEV لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.
Abstract
تلعب المناعة الخلوية التائية دورا مهما في السيطرة على عدوى الفيروس المصفر ، إما بعد التطعيم أو بعد العدوى الطبيعية. يجب تقييم "جودة" الخلية التائية حسب الوظيفة ، وترتبط الوظيفة الأعلى بحماية مناعية أكثر قوة. تسمى الخلايا التائية التي يمكنها إنتاج اثنين أو أكثر من السيتوكينات أو الكيموكينات في وقت واحد على مستوى الخلية الواحدة بالخلايا التائية متعددة الوظائف (T PF s) ، والتي تتوسط الاستجابات المناعية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية للتعبير عن علامات التحلل (CD107a) وإفراز الإنترفيرون (IFN) -γ ، أو عامل نخر الورم (TNF) -α ، أو الإنترلوكين (IL) -2 ، أو بروتين التهاب البلاعم (MIP) -1α. هناك أدلة متزايدة على أن TPFs ترتبط ارتباطا وثيقا بالحفاظ على الذاكرة المناعية طويلة المدى والحماية وأن نسبتها المتزايدة هي علامة مهمة على المناعة الوقائية وهي مهمة في السيطرة الفعالة على العدوى الفيروسية وإعادة التنشيط. لا ينطبق هذا التقييم على استجابات مناعية محددة فحسب ، بل ينطبق أيضا على تقييم الاستجابات المناعية التفاعلية المتقاطعة. هنا ، مع أخذ فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال ، تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFالخاص ب JEV الذي تنتجه خلايا الدم الطرفية أحادية النواة للأطفال الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ الياباني لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.
Introduction
فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) هو فيروس مهم ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus ضمن عائلة Flaviviridae1. لطالما واجهت العديد من دول آسيا والمحيط الهادئ تحديات هائلة في مجال الصحة العامة بسبب عبء المرض الهائل الناجم عن التهاب الدماغ الياباني (JE) ، ولكن هذا تحسن بشكل كبير مع زيادة توافر أنواع مختلفة من اللقاحات2. تساهم الاستجابات المناعية الوقائية التكيفية التي تثيرها العدوى الطبيعية أو التطعيم في الوقاية والتنظيم المضاد للفيروسات. تصنف المناعة الخلطية والمناعة الخلوية على أنها مناعة تكيفية ، وكان تحريض الأول يعتبر دائما استراتيجية رئيسية في تصميم اللقاح ، وإن كان ذلك بفهم محدود نسبيا في الماضي3. ومع ذلك ، فإن دور المناعة التائية بوساطة الخلايا التائية في الحد من انتشار الفيروس المصفر وإزالة الفيروسات قد تم التركيز عليه بشكل متزايد ودراسته على نطاق واسع4. علاوة على ذلك ، لا لا غنى عن مناعة الخلايا التائية في الاستجابات المضادة للفيروسات الخاصة ب JEV فحسب ، بل تلعب أيضا دورا بارزا في الحماية المتصالبة من العدوى الثانوية بالفيروسات المصفرة غير المتجانسة ، والتي تم إثباتها في الدراسات السابقة5. من المتوقع أن هذا التأثير قد يتجاوز تأثيرات التعزيز المحتملة بوساطة الأجسام المضادة في العدوى5. تجدر الإشارة إلى أن مناعة الخلايا التائية المتصالبة هذه مهمة ، خاصة في حالة عدم وجود لقاحات وأدوية مضادة للفيروسات ضد الفيروسات المصفرة. على الرغم من إجراء العديد من الدراسات لتحديد مساهمة الخلايا التائية في عدوى JEV فيما يتعلق بالخلايا التائيةCD4 + و CD8 + 6,7 ، إلا أن السلالات المعنية التي تفرز السيتوكينات وتنوعها الوظيفي لا تزال غير محددة ، مما يعني أن توضيح الوظائف الدقيقة للخلايا التائية المساعدة والقاتلة يعوق.
يحدد حجم دفاعاتهم المضادة للفيروسات جودة استجابات الخلايا التائية. تتميز الخلايا التائية CD4 + أو CD8 + التي يمكن أن تمنح وظيفتين أو أكثر ، بما في ذلك إفراز السيتوكين وإزالة التحلل ، بأنها خلايا تائية متعددة الوظائف (TPFs) عند تحفيز محدد على مستوى الخلية الواحدة8. قد يكون للخلايا التائية CD4 + التي تنتج سيتوكينات مفردة أو متعددة تأثيرات مختلفة وذكريات مناعية. على سبيل المثال ، من المرجح أن تشكل الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + استجابة وقائية فعالة طويلة الأجل من الخلايا التائيةIL-2 + CD4 + 9 ، والتي يمكن استخدامها كمعلمة مهمة في تقييم تأثير التطعيم. يزداد تواتر الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + في المرضى الذين يعانون من عدم تطور متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) على المدى الطويل ، في حين أن الخلايا التائية CD4 + في المرضى الذين يعانون من تطور الإيدز أكثر ميلا لإنتاج IFN-γ وحدها بسبب التأثير المعزز ل IL-2 على تكاثر الخلايا التائية10. علاوة على ذلك ، تبين أن مجموعة فرعية من IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ تعيش على المدى الطويل في الجسم الحي وتعزز بشكل تآزري وظيفة القتل11. على الرغم من أن الخلايا التائية CD8 + من المرجح أن تظهر نشاطا ساما للخلايا ، إلا أن بعض الخلايا التائية CD4 + مجهزة أيضا بنشاط سام للخلايا كتعبير مكتشف بشكل غير مباشر عن جزيئات CD107a السطحية12. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر مجموعات فرعية معينة من الخلايا التائية عن chemokine MIP-1α ، والذي غالبا ما تفرزه الخلايا الوحيدة للمشاركة في تجنيد العدلات بوساطة الخلايا التائية13. وبالمثل ، يمكن أيضا استخدام CD8 + TPFs لتوصيف تعدد استخدامات العلامات المذكورة أعلاه. أظهرت الدراسات أن استراتيجية التعزيز الأولي يمكن أن تحفز بشكل فعال فترة طويلة من التأثيرات الوقائية TPF 13 ، والتي يمكن أن تعزز الحماية التي يسببها التطعيم. تتمثل إحدى السمات المركزية في فحص الجهاز المناعي في قدرة خلايا الذاكرة التائية على تسهيل استجابات أقوى وأسرع وأكثر فعالية للتحديات الفيروسية الثانوية من الخلايا التائية الساذجة. تعد الخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (TEM) وخلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM) مجموعات فرعية مهمة من الخلايا التائية التي غالبا ما يتم تمييزها عن طريق التعبير المركب CD27 / CD45RO أو CCR7 / CD45RA14. يميل TCM (CD27 + CD45RO + أو CCR7 + CD45RA-) إلى التوطين في الأنسجة اللمفاوية الثانوية ، بينما TEM (CD27- CD45RO + أو CCR7- CD45RA-) يتمركز في الأنسجة اللمفاوية والمحيطية15,16. يوفر TEM دفاعا فوريا ولكن غير مستدام ، بينما يحافظ TCM على الاستجابة عن طريق التكاثر في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتوليد مستجيبات جديدة17. وبالتالي ، بالنظر إلى أن خلايا الذاكرة يمكن أن تتوسط في استجابات استدعاء محددة وفعالة للفيروسات ، تثار أسئلة حول مساهمة هذه المجموعة الفرعية من الوظائف المتعددة.
مع تطور تقنية قياس التدفق الخلوي ، أصبح من الشائع اكتشاف علامات أكثر من 10 مجموعات وأنماط ظاهرية ومستضدات تمايز في وقت واحد ، وهو أمر مفيد لشرح السمات المناعية الوظيفية على الخلايا التائية الفردية بشكل أكثر وفرة لتقليل سوء التفسير والصعوبات في فهم الأنماط الظاهرية للخلايا التائية. استخدمت هذه الدراسة التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح TPF في خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) داخل الأطفال الذين تم تطعيمهم ب JEV. بتطبيق هذا النهج ، سيتم توسيع فهم مناعة الخلايا التائية قصيرة وطويلة الأجل الخاصة ب JEV وحتى المتصالبة التفاعلية التي يسببها التطعيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية للدراسة الحالية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية (رقم الموافقة: 2020-k-85). تم تجنيد متطوعين من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية. تم الحصول على عينات الدم الوريدي المحيطي من الأطفال الأصحاء ظاهريا (2 سنة) الذين تلقوا سابقا تطعيما أوليا ومعززا بلقاح JE SA14-14-2 الحي الموهن لمدة تقل عن نصف عام (الأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE ، ن = 5) والأطفال غير الملقحين (6 أشهر ، ن = 5). تم التنازل عن الموافقة المستنيرة للبشر حيث تم استخدام العينات المتبقية فقط ، بعد اختبارها سريريا ، في هذه الدراسة. لحماية خصوصية المتطوعين ، تم إخفاء هوية جميع البيانات بالكامل وإلغاء تحديدها.
1. عزل PBMCs من الدم الوريدي المحيطي
- اجمع عينات الدم الوريدي المحيطي (2 مل) من الأطفال الملقحين وغير الملقحين ب JE في أنابيب EDTA-K2 المضادة للتخثر (انظر جدول المواد) باستخدام تقنية بزل الوريد القياسية18.
- أضف 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) لتخفيف الدم المحيطي.
ملاحظة: يتم التعامل مع العملية في أقرب وقت ممكن للحفاظ على أقصى قدر من البقاء على قيد الحياة. - أضف 4 مل من وسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وانقل الدم المخفف ببطء إلى الطبقة العليا من وسط الفصل.
ملاحظة: لا تخلط الدم مع وسط الفصل أو تدمر سطح التلامس الذي يتكون من السائلين ؛ خلاف ذلك ، لن يتحقق تأثير الفصل. - جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مراقبة الطبقات الهامة بعد الطرد المركزي.
- انقل PBMCs (الطبقة الوسطى) إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل ، واغسل PBMCs ب 10 مل من وسط RPMI-1640 يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS ، انظر جدول المواد).
- جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة بعناية.
- أعد تعليق PBMCs باستخدام 1 مل من وسيط RPMI-1640 يحتوي على 10٪ FBS وعد الخلايا باستخدام عداد آلي قائم على تريبان أزرق (انظر جدول المواد).
2. تحفيز PBMCs بواسطة جزيئات JEV المعطلة للحث على تعبير السيتوكين
- قم بتعيين مجموعتين فرعيتين من مجموعات التحفيز والتحكم JEV في العينات الملقحة وغير الملقحة ، على التوالي.
- اضبط عدد PBMCs على 2 × 10 6 خلايا / مل مع وسيط RPMI-1640 يحتوي على 10٪ FBS ، وزرع PBMCs في 24 لوحة بئر (2 × 106 خلايا / 1 مل وسط لكل بئر) ؛ تلقيح ثلاثة آبار لكل مجموعة.
- تحفيز PBMCs لمجموعة تحفيز JEV مع جزيئات JEV المعطلة المركزة 5 (2 × 105 PFU) لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD28 (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) و CD49d (1 ميكروغرام / مل) ، GolgiPlug (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) ، ومونينسين (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000). لتلطيخ السطح ، استخدم BV605-anti-CD107a (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تم تعطيل JEV عن طريق الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح سابقا19. - تحفيز PBMCs للمجموعة الضابطة بدون جزيئات الفيروس المركزة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD28 (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) و CD49d (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) ، GolgiPlug (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000) ، ومونينسين (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000). قم بتلطيخ السطح باستخدام BV605-anti-CD107a (1 ميكروغرام / مل ، 1: 1000).
3. تلطيخ خارج الجسم الحي داخل الخلايا
- اجمع معلق الخلية من كل مجموعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS ، وأضف صبغة صلاحية قابلة للتثبيت (1 ميكرولتر / مل ، 1: 1000 ، انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية.
- أداء تلطيخ علامة سطح الخلية.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS ، وأضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد لعلامات السطح (BV650-anti-CD3 ، BUV395-anti-CD4 ، BV421-anti-CD8 ، BUV737-anti-CD27 ، و BV480-anti-CD45RO ، عامل التخفيف: 1:50 ، انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية في كل أنبوب.
ملاحظة: يظهر بروتوكول تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية الملونة في الجدول 1. - احتضان الأنابيب (الخطوة 3.4.1) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وحمايتها من الضوء. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية.
ملاحظة: يمكن استبدال الجسم المضاد ل BUV737-anti-CD27 و BV480-anti-CD45RO ب BUV737-anti-CCR7 و BV480-anti-CD45RA كتعليق توضيحي لخلايا الذاكرة التائية.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS ، وأضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد لعلامات السطح (BV650-anti-CD3 ، BUV395-anti-CD4 ، BV421-anti-CD8 ، BUV737-anti-CD27 ، و BV480-anti-CD45RO ، عامل التخفيف: 1:50 ، انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية في كل أنبوب.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية.
- أداء التثبيت وكسر الغشاء.
- أعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول التثبيت الغشائي (انظر جدول المواد) وقم بإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية.
- أداء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS ، وأضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد للسيتوكين (FITC-anti-IFN-γ ، PE-anti-TNF-α ، BV785-anti-IL-2 ، و APC-anti-MIP-1α ، عامل التخفيف: 1:50 ، انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية في كل أنبوب.
ملاحظة: يتم عرض الأحجام والمعلومات المتعلقة بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور في الجدول 1. - احتضان الأنابيب (الخطوة 3.8.1) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS ، وأضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد للسيتوكين (FITC-anti-IFN-γ ، PE-anti-TNF-α ، BV785-anti-IL-2 ، و APC-anti-MIP-1α ، عامل التخفيف: 1:50 ، انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية في كل أنبوب.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS لإعادة تعليق الخلايا.
4. إعداد قياس التدفق الخلوي
- اعزل عينة PBMC وحدها باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوة 1 كعينة التحكم. قسم معلق الخلية إلى 12 جزءا متساويا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (100 ميكرولتر / أنبوب) كما هو مذكور أدناه.
- قم بإعداد ملطخ غير ملوث ، APC-Cy7-live / dead قابل للتثبيت ، BV650-anti-CD3 ملطخ واحد ، BUV395-anti-CD4 ملطخ واحد ، BV421-anti-CD8 ملطخ واحد ، BUV737-anti-CD27 ملطخ واحد ، BV480-anti-CD45RO ملطخ ، BV605-anti-CD107a ، FITC-anti-IFN-γ ملطخ ، PE-anti-TNF-α واحد ملطخ ، BV785-anti-IL-2 واحد ملطخ ، و APC-anti-MIP-1α عينات مفردة اللون.
- أضف علامات سطح الخلية وتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 3. لكل عينة تلطيخ واحدة ، أضف واحدة فقط من الفلوروفورات من خطوة التلطيخ. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS لإعادة تعليق الخلايا والدوامة بسرعة منخفضة.
- باستخدام عينة غير ملوثة ، اضبط التشتت الأمامي (FSC) ، والتشتت الجانبي (SSC) ، وجهد صبغة الفلورسنت المختلفة.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم ضبط الفولتية التالية. FSC: 440 فولت ، SSC: 233 فولت ، BV650: 575 فولت ، APC-Cy7: 449 فولت ، BUV395: 500 فولت ، BV421: 402 فولت ، BUV737: 585 فولت ، BV480: 444 فولت ، BV605: 457 فولت ، FITC: 475 فولت ، PE: 469 فولت ، APC: 623 فولت ، و BV785: 725 فولت. - باستخدام عينات التلوين الفردي ، اضبط تعويض قياس التدفق الخلوي للتخلص من إشارات التلوث بين الفلوروفورات المختلفة.
ملاحظة: معلمات التعويض موضحة في الجدول 2.
5. استراتيجية البوابات وتحليل البيانات
ملاحظة: في هذه الدراسة ، لهذا التحليل ، تم تعريف خلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM للخلايا التائية CD8 + أو CD4 + T ك CD27 + CD45RO + أو CCR7 + CD45RA- وخلايا الذاكرة التائية المستجيبة (TEM) للخلايا التائية CD8 + أو CD4 + T على أنها CD27- CD45RO + أو CCR7- CD45RA- على التوالي16.
- ارسم بوابة مضلعة عبر مخطط نقطي لمنطقة FSC (FSC-A) / SSC-AREA (SSC-A) لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة مع استبعاد الحطام (الشكل 1 أ).
- ارسم بوابة مستطيلة من خلال مخطط النقاط FSC-A / FSC-WIDTH (FSC-W) لتحديد الخلايا المفردة (الشكل 1B).
- ارسم بوابة مستطيلة من خلال مخطط النقاط الحية / الميتة / SSC-A لتحديد الخلايا الحية (الشكل 1C).
- ارسم بوابة مستطيلة من خلال مخطط النقاط CD3 / SSC-A لتحديد خلايا CD3 + T (الشكل 1D).
- ارسم بوابة رباعية من خلال مخطط النقاط CD4 / CD8 لتحديد خلايا CD4 + أو CD8 + T (الشكل 1E).
- ارسم بوابة رباعية من خلال مخطط النقاط CD45RO / CD27 لتقسيم خلايا CD4 + أو CD8 + T إلى TCM (CD27 + CD45RO +) و TEM (CD27- CD45RO +) (الشكل 1F-I).
- ارسم بوابات CD107a و IFN-γ و TNF-α و IL-2 و MIP-1α من TCM أو TEM لخلايا CD8 + أو CD4 + T لتحديد تردد أنماط الاستجابة المختلفة ، على التوالي.
- قم بتحميل العينات على القياس الخلوي بالتتابع. استخدم بوابة التوقف 20 للحصول على 1 ×10 6 الخلايا الليمفاوية.
ملاحظة: يمكن للمستخدم الفردي جمع أكثر من 1 × 106 خلايا. كان هذا الرقم حلا وسطا بين الوقت المستغرق وجمع ما يكفي من الخلايا لتقديم نتائج ذات مغزى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابة المستخدمة لتقسيم TCM أو TEM لخلايا CD8 + أو CD4 + T من مجموعة تحفيز JEV تمثيلية للأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE. يستخدم مخطط النقاط FSC-A / SSC-A لتحديد الخلايا الليمفاوية ، ويتم استخدام مخطط النقاط FSC-A / FSC-W لتحديد الخلايا المفردة. يتم اختيار الخلايا القابلة للحياة على مخطط النقاط الحية / الميتة / SSC-A. يستخدم مخطط النقاط CD3 / SSC-A لتحديد خلايا CD3 + T. يستخدم مخطط النقاط CD4 / CD8 لتحديد خلايا CD3 + CD4 + و CD3 + CD8 + T ، على التوالي. يتم تحديد TCM (CD27 + CD45RO +) و TEM (CD27- CD45RO +) لخلايا CD8 + أو CD4 + T بشكل منفصل على مخطط النقاط CD45RO / CD27. يتم اختيار الخلايا ذات النمط الظاهري ل CD107a + و IL-2 + و TNF-α+ و IFN-γ+ و MIP-1α + من CD8 + T CM (الشكل 1F) و CD8 + T EM (الشكل 1G) و CD4 + TCM (الشكل 1H) و CD4 + T EM (الشكل 1I) بشكل منفصل عن طريق رسم البوابة المستطيلة المقابلة.
يوضح الجدول 3 التوصيف متعدد الوظائف للذاكرة المركزية والمستجيبة CD4 + و CD8 + T استجابات الخلايا التائية (بما في ذلك التحبب والسيتوكينات والكيموكينات) ل JEV في الأطفال الملقحين وغير الملقحين ب JE. تشير هذه النتائج إلى أنه تم اكتشاف مستويات متزايدة من CD107a و IFN-γ و TNF-α و IL-2 في خلايا CD8 + TCM للأطفال الذين تم تطعيمهم بعد تحفيز JEV مقارنة بتلك الموجودة في الأطفال غير الملقحين. لم يختلف مستوى MIP-1α بين المجموعتين. يعتقد أن الخلايا التائيةالكهرومغناطيسية تمارس تأثيرات مضادة للفيروسات مباشرة عند إعادة التحفيز باستخدام JEV. تم الكشف عن مستويات أعلى من CD107a و IFN-γ في خلايا CD8 + TEM للمجموعة الملقحة تحت تحفيز JEV مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. ومع ذلك ، لم تكن TNF-α و IL-2 و MIP-1α مرتفعة بشكل ملحوظ في تلك الخلايا الإيجابية.
نجح مستضد JEV في إحداث مستويات أعلى من CD107a و IFN-γ و TNF-α و MIP-1α في خلايا CD4 + TCM للمجموعة الملقحة مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. ومع ذلك ، لم تختلف نسبة خلايا IL-2 + بين المجموعتين تحت تحفيز JEV. كانت نسبة المجموعات الفرعية CD107a + و IFN-γ + و TNF-α + من خلايا CD4 + T EM في المجموعة الملقحة أعلى في وجود JEV منها في المجموعة غير الملقحة.
الشكل 1: رسم توضيحي لاستراتيجية البوابة لتحديد TCM أو TEM لخلايا CD8+ أو CD4+ T ومجموعاتها الفرعية. (أ) تم تحديد الخلايا الليمفاوية باستخدام مخطط النقاط FSC-A/SSC-A. (ب) تم تحديد الخلايا المفردة باستخدام مخطط النقاط FSC-A / FSC-W. (ج) تم تحديد الخلايا الحية باستخدام مخطط النقاط الحية / الميتة / SSC-A. (د) تم تحديد الخلايا التائية CD3+ باستخدام المخطط النقطي CD3/SSC-A. (ه) تم تحديد خلايا CD3+ CD4+ T وخلايا CD3+ CD8+ T باستخدام المخطط النقطي CD4/CD8. (F) تم تقسيم CD8 + TCM مع النمط الظاهري ل CD107a + و IL-2 + و TNF-α + و IFN-γ + و MIP-1α + بشكل منفصل. (ز) تم تقسيم CD8+ TEM مع الأنماط الظاهرية الخمسة بشكل منفصل. (H) تم تقسيم CD4 + TCM مع الأنماط الظاهرية الخمسة بشكل منفصل. (I) تم تقسيم CD4 + TEM مع الأنماط الظاهرية الخمسة بشكل منفصل. تمثل الأرقام الموجودة على كل لوحة النسبة المئوية للخلايا في البوابات. يمثل الترميز اللوني تكرار حدوث الخلايا ، حيث الأحمر هو أعلى تردد والأزرق هو الأدنى. الاختصارات: SSC-A = منطقة التشتت الجانبية ؛ FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ FSC-W = عرض التشتت الأمامي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| هدف الأجسام المضادة | الفلوروفور المترافق | جرعة | استنساخ | إيزوتايب | خط ليزر الإثارة | إكس ماكس (نانومتر) | إم ماكس (نانومتر) |
| سي دي 3 | BV650 | 2 ميكرولتر | SK7 | الماوس IgG1, κ | بنفسج | 407 | 650 |
| سي دي 4 | BUV395 | 2 ميكرولتر | SK3 | الماوس IgG1, κ | الاشعه فوق البنفسجيه | 348 | 39 |
| سي دي 8 | BV421 | 2 ميكرولتر | SK1 | الماوس IgG1, κ | بنفسج | 407 | 421 |
| سي دي 27 | BUV737 | 2 ميكرولتر | إل128 | الماوس IgG1, κ | الاشعه فوق البنفسجيه | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 ميكرولتر | UCHL1 | الماوس IgG2a, κ | بنفسج | 436 | 478 |
| سي سي آر 7 | BUV737 | 2 ميكرولتر | 3D12 | الجرذ IgG2a, κ | الاشعه فوق البنفسجيه | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 ميكرولتر | هاي 100 | الماوس IgG2b, κ | بنفسج | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 ميكرولتر | H4A3 | الماوس IgG1, κ | بنفسج | 407 | 602 |
| ايل -2 | BV785 | 2 ميكرولتر | MQ1-17H12 | الجرذ IgG2a, κ | بنفسج | 407 | 786 |
| IFN-γ | فيتسي | 2 ميكرولتر | 4 ثوان. ب3 | الماوس IgG1, κ | أزرق | 494 | 520 |
| TNF-α | بيه | 2 ميكرولتر | ماب 11 | الماوس IgG1, κ | أصفر-أخضر | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | ايه بي سي | 2 ميكرولتر | 11أ 3 | الماوس IgG2a, κ | أحمر | 650 | 660 |
| غيبوبة نير | APC-Cy7 | 1 ميكرولتر | - | - | أحمر | 650 | 779 |
الجدول 1: بروتوكول تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية الملونة لتحليلات قياس التدفق الخلوي. الاختصارات: BV = البنفسج اللامع. BUV = الأشعة فوق البنفسجية الرائعة. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين.
| مرجع التعويض لقياس التدفق الخلوي (٪) | ||||||||||||
| فيتسي | ايه بي سي | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | بيه | ||
| فيتسي | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| ايه بي سي | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| بيه | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
الجدول 2: بارامترات التعويض لتحليلات قياس التدفق الخلوي. الاختصارات: BV = البنفسج اللامع. BUV = الأشعة فوق البنفسجية الرائعة. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين.
| مجموعة من TPF | توصيف متعدد الوظائف (٪) | |||||||
| التحفيز | CD107a | IFN-γ | TNF-α | ايل -2 | MIP-1α | |||
| خلايا CD8+ التائية | تيسي إم | تطعيم | جيف | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0.66±0.32 | 0.54±0.27 | 0.16±0.11 |
| السيطرة | 0.51±0.38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| غير الملقحين | جيف | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| السيطرة | 0.50±0.28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| قيمة P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| تيإي إم | تطعيم | جيف | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0.49±0.36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| السيطرة | 0.82±0.48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| غير الملقحين | جيف | 0.41±0.25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| السيطرة | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| قيمة P* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| خلايا CD4+ التائية | تيسي إم | تطعيم | جيف | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0.57±0.25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| السيطرة | 0.44±0.27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| غير الملقحين | جيف | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| السيطرة | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| قيمة P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| تيإي إم | تطعيم | جيف | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0.89±0.25 | 0.37±0.22 | 0.21±0.05 | |
| السيطرة | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| غير الملقحين | جيف | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| السيطرة | 0.35±0.21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| قيمة P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * اختبار Mann-Whitney U ، PBMCs من الفرد الذي تم تطعيمه بتحفيز JEV مقابل. تم عرض PBMCs من الأفراد غير الملقحين الذين تم تحفيزهم بواسطة JEV فقط. | ||||||||
الجدول 3: توصيف متعدد الوظائف ل TCM و TEM لاستجابات الخلايا التائية CD4 + أو CD8 + ل JEV. تطعيم ، ن = 5 ؛ غير ملقح ، ن = 5. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SD. P < 0.05 أشار إلى فرق كبير. * يتم عرض PBMCs من الأفراد الذين تم تطعيمهم بتحفيز JEV مقابل PBMCs من الأفراد غير الملقحين الذين تم تحفيزهم بواسطة JEV فقط. الاختصارات: TPFs = الخلايا التائية متعددة الوظائف ؛ IFN-γ = مضاد للفيروسات γ ؛ TNF-α = عامل نخر الورم α ؛ IL-2 = إنترلوكين -2 ؛ MIP-1α = بروتين التهاب البلاعم -1α ؛ TCM = خلايا الذاكرة التائية المركزية ؛ TEM = الخلايا التائية ذاكرة المستجيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمثل هذا البروتوكول طريقة كشف مجدية قائمة على قياس التدفق الخلوي لملفات تعريف TPF في PBMCs للأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح JEV SA14-14-2. استخدمت هذه الدراسة PBMCs الدم الوريدي لكل من الأطفال الملقحين وغير الملقحين كمواد بحثية. مع تحفيز PBMCs مع مستضد JEV ، يمكن تمييز تلك TPF sالمضخمة الخاصة بالمستضد بتلطيخ الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. بالمقارنة مع طريقة مقايسة البقع المناعية التقليدية المرتبطة بالإنزيم ، فإن الميزة البارزة لقياس التدفق الخلوي هي تقديم السمات الوظيفية ل PBMCs على مستوى الخلية الواحدة بأكبر قدر ممكن من التنوع ، مما يقلل من عدد PBMCs المطلوبة للكشف ، وهو مناسب بشكل خاص للأطفال.
يعد تاريخ التطعيم الواضح ، والحفاظ على صلاحية الخلية ، ومناعة الخلايا التائية للمحفز ، واستراتيجيات مطابقة الألوان المتوافقة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. أدرجت الصين تطعيم JEV SA14-14-2 في برنامج التحصين الوطني الموسع منذ عام 2008 وأدرجت تاريخ التطعيم في الإدارة الموحدة ، والتي أصبحت متاحة للوصول إلى تاريخ اللقاح3. تم الاحتفاظ ب PBMCs التي تم فحصها في هذا البروتوكول تجريبيا على الجليد للحفاظ على أقصى قدر من بقاء الخلية. وقد ثبت سابقا على نطاق واسع أن استخدام محفزات محددة فعال4،5،21،22. استراتيجية مطابقة الألوان هي القيد الرئيسي في هذه الطريقة ، وقد تم تقديم قابلية استخدام هذه الاستراتيجية في التحسين المستمر قبل الاختبار ومطابقة معلمة الأداة. بالإضافة إلى ذلك ، قدم هذا البروتوكول خيارين للتعليق على خلايا الذاكرة التائية. من خلال التكوين أعلاه وتحسين المعلمات التجريبية ، قد يكون من الممكن قياس مناعة محددة وحتى تفاعلية من خلال تقييم حجم وتواتر استجابات TPF للتطعيم عن طريق قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، فإن المؤشرات التمثيلية الخمسة لتوصيف TPFs هي أحد قيود هذه الدراسة. يمكن توسيع الجزيئات الوظيفية الشائعة حاليا (CD107a و IFN-γ و TNF-α و IL-2 و MIP-1α) للكشف عن الطيف من أجل توصيف تنوع TPFs بشكل كامل بناء على البروتوكول المقدم.
تعتبر عدوى JEV مرضا يمكن الوقاية منه بالتطعيم حيث قد تكون استجابات الخلايا التائية للذاكرة المستحثة بالتطعيم حاسمة في الحفاظ على حماية مناعية طويلة الأمد ، خاصة مع تضاؤل استجابات الأجسام المضادة بمرور الوقت4. كمكون وقائي رئيسي كامل القدرة في خلايا الذاكرة التائية ، يجب اقتراح TPFs كعنصر اختبار روتيني لتقييم فعالية اللقاح ، وعلى العكس من ذلك ، توجيه تصميم وتطوير لقاحات الخلايا التائية المستهدفة. في الواقع ، أصبح دور مناعة الخلايا التائية في مكافحة عدوى الفيروس المصفر موضع تقدير متزايد ، ويمكنه حتى تجاوز دور الأجسام المضادة للأفضل أو الأسوأ5. ومما لا شك فيه أن توضيح ملف تعريف TPF سيزيد من تضييق ذخيرة الحلقات المستضدية ، والتي لا بد أن تقلل من تكلفة اللقاحات من خلال تحسين الاستهداف. تكمل التأثيرات التآزرية لخلايا CD4 + و CD8 + T بعضها البعض وهي بلا شك أكثر بروزا في TPF. لذلك ، يقترح أن تركز الدراسات المتعلقة ب T PF s على (1) الاختلافات في الملامح بين TPFعلى المدى الطويل والقصير؛ (2) تحديد حوائط TPF المقيدة ب HLA ؛ و (3) استكشاف وبحث المزيد من المجموعات السكانية الفرعية متعددة الوظائف.
تم الإبلاغ عن تحديد خلايا TPF في السيطرة المناعية للعدوى الفيروسية23،24،25. ومع ذلك ، فإن وصف استراتيجية الكشف الكاملة وعملية TPFs لم يتم تنظيمه بشكل جيد. علاوة على ذلك ، ينطبق نظام ألوان هذه الطريقة على نماذج مقياس التدفق الخلوي المتعددة. يمكن أيضا ضبط العلامات لاكتشاف المجموعات الفرعية الوظيفية الأخرى بناء على مطابقة الألوان هذه.
قدمت هذه الدراسة استراتيجية للكشف عن T PF من خلال الجمع بين التحفيز النوعي خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملفات تعريف مجموعة فرعية TPF في PBMCs لمتلقي لقاح JEV. تم تحفيز PBMCs المعزولة أولا باستخدام مستضد JEV ثم تلطيخها بالأجسام المضادة المقابلة ذات العلامات الفلورية ، وتم تمييز ذاكرة CD4 + و CD8 + الخاصة ب JEV TPFبقياس التدفق الخلوي. بناء على هذه النتيجة ، يمكن حساب ترددات T PF للوظائف المزدوجة والثلاثية والرباعية والخماسية لوصف TPF s بمزيد من التفصيل وبشكل أكثر شمولا. ثبت أن أحجام الدم الوريدي الروتينية (2 مل) عند الأطفال كافية لدراسات TPF. لذلك ، من المتوقع استخدام طرق الكشف عن TPFالخاصة بالفيروس لاستكشاف مقاييس المناعة التكيفية بوساطة الخلايا التائية المرتبطة بالتطعيم أو العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم RW من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ، مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية في الصين (7222059). تم دعم ZD.X. من قبل صندوق الابتكار CAMS للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
