Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة رقاقة الموائع الدقيقة السريرية لعزل الخلايا السرطانية المنتشرة متعددة الاستخدامات

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/64674
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

Summary

رقاقة الموائع الدقيقة السريرية هي تقنية تحليل طبي حيوي مهمة تبسط المعالجة المسبقة لعينات دم المريض السريرية وتلطخ الخلايا السرطانية المنتشرة في الموقع على الرقاقة ، مما يسمح بالكشف السريع وتحديد CTC واحد.

Abstract

تعتبر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) مهمة في تشخيص السرطان والتشخيص والعلاج المضاد للسرطان. يعد تعداد CTC أمرا حيويا في تحديد مرض المريض لأن CTCs نادرة وغير متجانسة. يتم فصل CTCs عن الورم الرئيسي ، وتدخل نظام الدورة الدموية ، ويحتمل أن تنمو في مواقع بعيدة ، وبالتالي تنتشر الورم. نظرا لأن CTCs تحمل معلومات مماثلة للورم الرئيسي ، فإن عزل CTC والتوصيف اللاحق يمكن أن يكون حاسما في مراقبة السرطان وتشخيصه. يعد التعداد وتعديل التقارب وتلطيخ التألق المناعي السريري ل CTCs النادرة طرقا قوية لعزل CTC لأنها توفر العناصر الضرورية ذات الحساسية العالية. تقدم رقائق الموائع الدقيقة طريقة خزعة سائلة خالية من أي ألم للمرضى. في هذا العمل ، نقدم قائمة بالبروتوكولات الخاصة برقائق الموائع الدقيقة السريرية ، وهي منصة عزل CTC متعددة الاستخدامات ، والتي تتضمن مجموعة من الوظائف والخدمات المطلوبة لفصل CTC وتحليلها وتشخيصها المبكر ، وبالتالي تسهيل التحليل الجزيئي الحيوي وعلاج السرطان. يتضمن البرنامج عد الخلايا السرطانية النادرة ، والمعالجة المسبقة لدم المريض السريري ، والتي تشمل تحلل خلايا الدم الحمراء ، وعزل والتعرف على CTCs في الموقع على رقائق الموائع الدقيقة. يسمح البرنامج بالتعداد الدقيق للخلايا السرطانية أو CTCs. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البرنامج أداة تتضمن عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة متعددة الاستخدامات وتحديد التألق المناعي في الموقع على الرقائق ، يليه التحليل الجزيئي الحيوي.

Introduction

تعتبر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) مهمة في تشخيص السرطان والتشخيص والعلاج المضاد للسرطان. يعد تعداد CTC أمرا حيويا لأن CTCs نادرة وغير متجانسة. يعد التعداد وتعديل التقارب وتلطيخ التألق المناعي السريري ل CTCs النادرة تقنيات قوية لعزل CTC لأنها توفر العناصر الضرورية ذات الحساسية العالية1. عدد نادر من الخلايا السرطانية الممزوجة بالدم الطبيعي تحاكي عن كثب دم المريض الحقيقي لأن 2-3 مل من دم المريض الحقيقي يحتوي فقط على 1-10 CTCs. لحل مشكلة تجريبية حرجة ، بدلا من استخدام عدد كبير من الخلايا السرطانية التي تم إدخالها في برنامج تلفزيوني أو مختلطة بالدم الطبيعي ، فإن استخدام عدد نادر من الخلايا السرطانية يوفر لنا عددا منخفضا من خلايا الدم ، وهو أقرب إلى الواقع عند إجراء تجربة.

السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في العالم2. CTCs هي خلايا سرطانية يتم التخلص منها من الورم الأصلي الذي يدور في الدم وأنظمة الدورة اللمفاوية3. عندما تنتقل CTCs إلى بيئة جديدة قابلة للبقاء ، فإنها تنمو كورم ثان. وهذا ما يسمى ورم خبيث وهو مسؤول عن 90 ٪ من الوفيات في مرضى السرطان4. CTCs حيوية للتشخيص والتشخيص المبكر وفهم آليات السرطان. ومع ذلك ، فإن CTCs نادرة للغاية وغير متجانسة في دم المريض 5,6.

تقدم رقائق الموائع الدقيقة خزعة سائلة لا تغزو الورم. لديهم ميزة كونها محمولة ومنخفضة التكلفة ولديها مقياس مطابق للخلايا. يصنف عزل CTCs مع رقائق الموائع الدقيقة بشكل أساسي إلى نوعين: قائم على التقارب ، والذي يعتمد على ارتباط الأجسام المضادةللمستضد 7،8،9 وهو الطريقة الأصلية والأكثر استخداما لعزل CTC. والرقائق الفيزيائية ، التي تستخدم اختلافات الحجم والتشوه بين الخلايا السرطانية وخلايا الدم 10،11،12،13،14،15 ، خالية من الملصقات وسهلة التشغيل. تتمثل ميزة رقائق الموائع الدقيقة على التقنيات البديلة في أن النهج القائم على المادية للمرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير يلتقط بقوة CTCs بكفاءة التقاط عالية. والسبب في ذلك هو أن الأعمدة الدقيقة البيضاوي يتم تنظيمها في أنفاق رفيعة من فجوات خط الخط. تختلف فجوات الخط الخطي عن الفجوات التقليدية بين النقاط والنقاط التي تشكلها الأعمدة الدقيقة مثل المعين الصغير. يجمع التقاط CTCs القائم على الشريحة الموجية بين العزلة القائمة على الخصائص المادية والقائمة على التقارب. يتضمن الالتقاط القائم على الشريحة الموجية 30 صفيفا على شكل موجة مع الجسم المضاد ل EpCAM المطلي على أعمدة دقيقة دائرية. يتم التقاط CTCs بواسطة الفجوات الصغيرة ، ويتم استخدام الفجوات الكبيرة لتسريع معدل التدفق. يجب أن تجتاز CTCs المفقودة الفجوات الصغيرة في المصفوفة التالية ويتم التقاطها من خلال العزلة القائمة على التقارب المدمجة داخل الشريحة16.

الهدف من البروتوكول هو إظهار عد أعداد نادرة من الخلايا السرطانية والتحليل السريري ل CTCs مع رقائق الموائع الدقيقة. يصف البروتوكول خطوات عزل CTC ، وكيفية الحصول على عدد منخفض من الخلايا السرطانية ، والفصل المادي السريري لمرشحات القطع الناقص الصغيرة ، ومرشحات القطع الناقص الكبير ، ومرشحات شبه المنحرف ، وتعديل التقارب ، والتخصيب17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم توفير عينات دم المريض من قبل مستشفى لونغهوا التابع لجامعة شنغهاي الطبية ، ويتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى جامعة بكين الثالث. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى لاستخدام العينات لأغراض البحث.

1. قبل التجربة للتحقق من كفاءة الالتقاط مع الخلايا السرطانية المستزرعة

  1. استزرع الخلايا السرطانية MCF-7 و MDA-MB-231 و HeLa لتحديد كفاءة الالتقاط. تمييع تعليق الخلايا السرطانية ، وحساب عدد الخلايا السرطانية ، وكرر حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    1. استزراع الخلايا في دورق زراعة الخلايا بعدد خلايا بداية ~ 1 × 105 خلايا في 1 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان في جو مرطب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 جو.
    2. عندما تنمو خطوط الخلايا كطبقات أحادية ملتصقة إلى التقاء 95٪ ، افصلها عن أطباق الاستزراع بمحلول التربسين 0.25٪ لمدة دقيقتين كما هو موضح في Chen et al.16.
    3. تلطيخ الخلايا السرطانية مع كالسيين AM. ضع 3 ميكرولتر من الكالسيين AM في طبق الاستزراع ، واحتفظ بالطبق في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. ثم، هضم جميع الخلايا مع التربسين.
    4. عد الخلايا السرطانية المزروعة في برنامج تلفزيوني مع غرفة عد الخلايا ، وقم بتخفيفها حتى يتم الحصول على 100 خلية سرطانية لكل 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: من أجل تعداد عدد الخلايا بدقة ، خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه لمعرفة ما إذا كان عدد الخلايا السرطانية فيه خمسة أم لا باستخدام المجهر. حدد حجم تعليق الخلية الذي يجب اتخاذه للحصول على 100 خلية سرطانية وفقا للعدد الفعلي للخلايا السرطانية في 50 ميكرولتر من تعليق الخلية.
  2. أدخل معلق الخلية الذي يحتوي على 100 خلية ورمية لكل 1 مل من PBS في رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام حقنة مع مضخة حقنة بمعدلات تدفق متنوعة تبلغ 0.5 مل / ساعة ، 1 مل / ساعة ، 2 مل / ساعة ، 3 مل / ساعة ، 4 مل / ساعة ، و 5 مل / ساعة. الحصول على كفاءة الالتقاط لمعدلات التدفق المختلفة ، وتحديد معدل التدفق الأمثل.
    1. احسب عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الشريحة وتتدفق من المخرج. احسب كفاءة الالتقاط على النحو التالي:
      كفاءة الالتقاط = عدد الخلايا الملتقطة / (عدد الخلايا الملتقطة + عدد الخلايا المتدفقة) × 100٪
    2. كرر للحصول على كفاءة الالتقاط لأعداد مختلفة من الخلايا السرطانية من 10 إلى 100 (10 ، 20 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 ، 70 ، 80 ، 90 ، 100).
  3. اختبار والتحقق من رقاقة الموائع الدقيقة لأعداد نادرة من الخلايا السرطانية. قم بحقن هذه المعلقات العشرة للعينات في رقائق الموائع الدقيقة باستخدام إبرة مجوفة مصنوعة من مجتذب ماصة دقيقة لشفط 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 خلايا سرطانية مخففة في 1 مل من برنامج تلفزيوني. كشف وتعداد عدد الخلايا السرطانية لكل عينة بعد التقاطها على الشريحة.
    ملاحظة: يبلغ طول الإبرة المجوفة حوالي 3 سم وقطرها الخارجي 1 مم.
  4. قم بإجراء اختبار سريري قبل التجربة للخلايا السرطانية المتصاعدة في عينات الدم الطبيعية.
    1. قم بتلطيخ الخلايا السرطانية باستخدام Calcein AM ، ثم قم بتعداد 100 خلية سرطانية في 5 ميكرولتر من PBS. قم برفع هذه الخلايا إلى 1 مل من عينات الدم الطبيعية الكاملة. أدخل هذه الخلايا في الشريحة ، وقم بتعداد عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الشريحة ذات التألق المناعي الأخضر. قم بإجراء التعداد في الجسم الحي على الشريحة كما هو موضح أعلاه ، واحسب كفاءة الالتقاط بعد الالتقاط.
    2. كرر الخطوة 1.4.1 لتسعة تركيزات إضافية من أعداد الخلايا السرطانية من 10 إلى 90 (10 ، 20 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 ، 70 ، 80 ، 90).
    3. تعداد 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 خلايا سرطانية كما هو موضح في الخطوة 1.3 دون تلطيخ ، والارتفاع إلى 1 مل من الدم الطبيعي الكامل ، وإدخال هذه العينات في رقاقة الموائع الدقيقة ، والتقاط الخلايا السرطانية على الشريحة.
    4. وصمة عار على رقاقة مع Hoechst ، CK-FITC ، و CD45-PE. ضع 3-5 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت في 20-30 ميكرولتر من PBS ، ثم أدخل هذا المحلول على شريحة الموائع الدقيقة باستخدام حقنة. قم بتعداد عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الرقاقة باستخدام كل من التألق المناعي الأزرق والأخضر لتحديد كفاءة الالتقاط.
  5. قم بإجراء تعديل لشريحة الموائع الدقيقة للالتقاط القائم على التقارب لمكافحة EpCAM.
    ملاحظة: نظرا لأن شريحة الموجة تجمع بين كل من العزلة القائمة على التقارب والقائمة على الخصائص المادية ، فقم بتعديل الشريحة باستخدام العوامل.
    1. قم بتعديل سطح الرقاقة ب 100 ميكرولتر من 4٪ (v / v) 3-mercaptopropyl trimethoxysilane في الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. أدخل هذا المحلول في الشريحة بعناية وببطء في حالة تدميره للهيكل الداخلي للرقاقة ، وخاصة الترابط بين السطح العلوي وزجاج الركيزة.
      ملاحظة: يتم تعديل سطح الرقاقة باستخدام ميركابتوسيلان. يتم تحديد التفاعلات التي تحدث على الرقاقة بواسطة الروابط الكيميائية. يتم إنشاء روابط كيميائية لتحقيق الترابط بين الجسم المضاد المعدل مع المستضد. يتم تعديل الكواشف المختلفة داخل الشريحة لإنشاء روابط كيميائية تتصل ببعضها البعض. آخر كاشف يتم تعديله هو جزيء التصاق مضاد للظهارة (مضاد ل EpCAM). يتحد مستضد سطح الخلية السرطانية ل EpCAM مع مضاد EpCAM داخل الشريحة لتحقيق التقاط CTCs.
    2. يغسل مع الإيثانول 3x. أضف 100 ميكرولتر من عامل التوصيل N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS ، 1 μM) على الشريحة ، واتركه يتفاعل لمدة 30 دقيقة.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3x. استخدم حقنة لإدخال 1 مل من برنامج تلفزيوني على الشريحة لغسلها.
    4. عالج الرقاقة ب 30-40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل نيوترافيدين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مما يؤدي إلى تجميد الخلايا على GMBS ، ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الأفيدين الزائد.
    5. قم بتعديل الشريحة ب 3 ميكرولتر من الجسم المضاد EpCAM المضاد للبيوتينيل بتركيز 10 ميكروغرام / مل في 100 ميكرولتر من PBS مع 1٪ (w / v) BSA. الحفاظ على هذا بين عشية وضحاها.

2. تجربة سريرية على الرقاقة لتعداد الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs)

  1. قبل المعالجة السريرية لعينات دم مرضى السرطان باستخدام محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBCL) ، أو أدخل 2-3 مل من عينة الدم مباشرة على شريحة الموائع الدقيقة باستخدام حقنة.
    1. قم بإجراء المعالجة المسبقة ، والتي تستغرق حوالي 30 دقيقة. جمع عينات الدم الكاملة في أنابيب منع التخثر. أضف 6-9 مل من محلول تحلل RBS إلى 2-3 مل من الدم. أجهزة الطرد المركزي عند 111 × جم لمدة 5-8 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من الطبقة العليا من السائل الأحمر الصافي.
  2. التقط الخلايا الموجودة على الشريحة وقم بتلطيخها والتعرف عليها وتعدادها كما هو موضح أدناه.
    1. التقط الخلايا الموجودة على الشريحة كما هو موضح في الخطوة 1.قم بتلطيخ الشريحة الخاصة ب CTCs التي تم التقاطها باستخدام Hoechst و CK-FITC و CD45-PE. CK-FITC هو بقعة محددة للخلايا السرطانية ، و CD45-PE لخلايا الدم البيضاء.
    2. أضف 3 ميكرولتر من CK-FITC إلى 20 ميكرولتر من PBS. أدخل هذا في المحقنة ، وضخ CK-FITC المخفف على الشريحة. اتركيه للبقع لمدة 30 دقيقة. أدخل 300 ميكرولتر من PBS على الشريحة لغسل الشريحة.
    3. أضف 3 ميكرولتر من CD45-PE إلى 20 ميكرولتر من PBS. أدخل هذا في المحقنة ، وضخ CD45-PE المخفف على الشريحة. اتركيه لمدة 30 دقيقة. أدخل 300 ميكرولتر من PBS على الشريحة لغسل الشريحة.
    4. حدد CTCs باستخدام مجهر مضان مقلوب عند تكبير 20x أو 40x. تنبعث CTCs من كل من التألق الأزرق والأخضر ، وخلايا الدم البيضاء (WBCs) تنبعث منها مضان أزرق وأحمر. حدد CTCs مع كل من مضان الأزرق والأخضر وكرات الدم البيضاء مع كل من مضان الأزرق والأحمر.
    5. من صور التألق المناعي ، قم بتعداد عدد CTCs التي تم التقاطها على الشريحة. تعداد CTCs ك Hoechst+/CK-FITC+/CD45− وكرات الدم البيضاء ك Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
  3. قم بإثراء CTCs الملتقطة عن طريق التنظيف باستخدام PBS من خلال المحقنة في الاتجاه العكسي على شريحة الموائع الدقيقة لجمع CTCs الملتقطة على الشريحة من المدخل. استخدم حقنة تحتوي على 1 مل من PBS ، وأدخلها من المنفذ لإثراء CTCs التي تم التقاطها على الشريحة في غضون 2-3 دقائق ، وجمعها من المدخل. استخدم 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل خطوة غسيل ، وكرر 3x.
  4. قم بتلطيخ الخلايا السرطانية أو CTCs التي تم التقاطها على شريحة الموائع الدقيقة كما هو موضح أدناه.
    1. وصمة عار باستخدام كالسيين AM. أضف 5 ميكرولتر من الكالسيين AM إلى 20 ميكرولتر من PBS ، وقم بتلطيخ الخلايا لمدة 30 دقيقة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 111 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على الخلايا السرطانية ، في 1 مل من PBS.
    2. لتحديد النوى الخلوية ، أضف 20 ميكرولتر من محلول DAPI (10 ميكرولتر من كاشف DAPI في 20 ميكرولتر من PBS) إلى الشريحة بمعدل التدفق الأمثل البالغ 1 مل / ساعة للمرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير و 1.5 مل / ساعة للمرشحات شبه المنحرفة. مرر 20 ميكرولتر من محلول المخزون المضاد للسيتوكيراتين (3 ميكرولتر من الأجسام المضادة للسيتوكيراتين في 20 ميكرولتر من PBS) للتفاعل مع الشريحة لمدة 30 دقيقة.
    3. وصمة عار كرات الدم البيضاء التي تم التقاطها على رقاقة. بعد التقاط CTCs على الرقاقة ، أضف 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة ل CD45 (5 ميكرولتر من محلول مضاد CD45 في 20 ميكرولتر من PBS) إلى الشريحة ، واتركها للبقع لمدة 30 دقيقة. اغسل مع برنامج تلفزيوني ، وحدد الخلايا الظهارية مع كل من مضان الأزرق والأخضر.
  5. قم بإجراء تحديد التألق المناعي باستخدام الفحص المجهري الفلوري كما هو موضح أدناه.
    1. استخدم مجهر مضان وإثارة العينة بالليزر الأزرق. أوجد الخلايا التي ينبعث منها مضان أزرق، وهي خلايا نواة. استخدم أحد التكبيرات التالية: 10x أو 20x أو 40x. ابحث عن حقل واضح للخلية السرطانية. بالنسبة لمصدر الليزر الأزرق ، استخدم طولا موجيا للوحة الإثارة يبلغ 420-485 نانومتر وطول موجة لوحة انبعاث يبلغ 515 نانومتر.
    2. بدون تحريك العينات ، استخدم مصدر ليزر آخر. قم بتدوير المجهر الفلوري وإثارة العينة بالليزر الأخضر. ابحث عن الخلايا التي تنبعث منها مضان أخضر ، مما يدل على الخلايا السرطانية. التقط صورا لنفس المجال بنفس التكبير باستخدام مصدر الليزر الأخضر هذا. يتم التعرف على الخلايا التي تنبعث منها مضان أزرق وأخضر كخلايا ورمية. بالنسبة لمصدر الليزر الأخضر ، استخدم طولا موجيا للوحة الإثارة يبلغ 460-550 نانومتر وطولا موجيا للوحة الانبعاث يبلغ 590 نانومتر
    3. بدون تحريك العينات ، استخدم مصدر ليزر آخر. قم بتدوير المجهر الفلوري وإثارة العينة بالليزر الأحمر. أوجد الخلايا التي ينبعث منها مضان أحمر. التقط صورا لنفس المجال بنفس التكبير باستخدام مصدر الليزر الأحمر هذا. يتم التعرف على الخلايا التي تنبعث منها مضان أزرق وأحمر على أنها خلايا دم بيضاء.
    4. احفظ الصورة للحصول عليها باستخدام كل مصدر من مصادر الليزر أعلاه. التقط عدة صور لنفس الحقل بأضواء ملونة مختلفة.
    5. استخدم الأشعة فوق البنفسجية بطول موجة لوحة الإثارة 330-400 نانومتر وطول موجة لوحة الانبعاث 425 نانومتر. استخدم الضوء الأرجواني بطول موجة لوحة إثارة 395-415 نانومتر وطول موجة لوحة انبعاث 455 نانومتر.
  6. احسب كفاءة الالتقاط كما في الخطوة 1.2.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتضمن الإعداد بأكمله مضخة حقنة وحقنة وشريحة ميكروفلويديك. يتم توصيل تعليق الخلية في المحقنة بمضخة المحقنة ، ويتم إدخال تعليق الخلية في رقاقة الموائع الدقيقة لالتقاط الخلايا. كانت كفاءة الالتقاط لجميع رقائق الموائع الدقيقة المستخدمة حوالي 90٪ أو أعلى. بالنسبة لرقاقة الموجة ، قمنا بتصميم الهياكل المجهرية ذات الفجوات المتنوعة. تستخدم الفجوات الصغيرة لالتقاط CTCs ، وتستخدم الفجوات الكبيرة لتسريع معدل التدفق. يتدفق تعليق الخلية بسرعة في مناطق الفجوة الكبيرة. تميل CTCs الفائتة إلى التقاطها من خلال الفجوات الصغيرة في الصفيف16 اللاحق. بالنسبة لرقائق القطع الناقص ، قمنا بتصميم فجوات خط الخط بدلا من فجوات النقطة لتشكيل نفق رفيع لتحسين الالتقاط. لذلك ، تم تحقيق كفاءة التقاط عالية1. لقد صممنا هيكلا بيحكما ناقصا لتجنب الحواف والزوايا للحفاظ على الجدوى. تحتوي المرشحات شبه المنحرفة على قناتين حلزونيتين دائريتين مع حواجز شبه منحرف ودائرية دائرية. بالنسبة للمرشحات شبه المنحرفة ، كانت كفاءات الالتقاط ل MCF-7 و MDA-MB-231 و HeLa 94٪ و 95٪ و 93٪ على التوالي18.

يوضح الشكل 1 أن جميع الخلايا السرطانية تم التقاطها بواسطة شريحة الموجة. نظرا لأن جميع الخلايا السرطانية كانت مركزة حول مجموعة micropost الموجية ، فإن هذا يشير إلى كفاءة التقاط عالية لشريحة الموائع الدقيقة هذه ، كما يتضح من عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها. لذلك ، فإن هذا الإعداد يجعل من الأسهل بكثير التقاط الخلايا السرطانية النادرة. في الواقع ، تم تصنيع الشريحة لالتقاط عدد كبير من الخلايا السرطانية بالإضافة إلى عدد نادر من الخلايا السرطانية. على سبيل المثال ، إذا كانت الشريحة صلبة أو قابلة للتكرار بما يكفي لالتقاط 10000 خلية ورمية ، فمن السهل على الشريحة التقاط 10-100 خلية. يوضح الفيديو 1 كيف تم الحصول على عدد نادر من الخلايا السرطانية للتجربة المسبقة. تم استخدام إبرة مجوفة مصنوعة باستخدام مجتذب ماصة دقيقة لشفط 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 خلايا سرطانية من طبق مزرعة مع خلايا سرطانية مخففة ملطخة بالكالسيين AM في PBS. تم امتصاص الخلايا بواسطة أنبوب هلام السيليكا المتصل بالإبرة المجوفة. تم شفط خلية ورمية ذات تألق مناعي أخضر في الإبرة المجوفة. أدى النفخ في الأنبوب المجوف إلى تفريغ الخلية السرطانية داخل الإبرة المجوفة في أنبوب الطرد المركزيالدقيق 1. هذا هو الإجراء للحصول على الخلايا السرطانية النادرة. يوضح الشكل 2 CTCs من مريض سرطان المعدة الذي تم التقاطه باستخدام المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الصغير. يوضح الشكل 3 CTCs من مريض سرطان القولون والمستقيم الذي تم التقاطه باستخدام مرشحات دقيقة شبه منحرف وينبعث منها مضان أزرق وأخضر. يوضح الشكل 4 الخلايا السرطانية التي تنمو على الرقاقة بعد التقاطها ، والتي تكون جاهزة للعلاج بالأدوية المضادة للسرطان. توضح هذه النتائج أن المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير ليس لها أي آثار سلبية على صلاحية الخلية.

يوضح الشكل 5 تحليل التألق المناعي السريري ل CTCs القولون والمستقيم التي تم التقاطها على رقاقة الموائع الدقيقة. تظهر هذه في برايتفيلد وملطخة بتلطيخ Hoechst و CK-FITC و CD45-PE. تم التعرف على CTCs على أنها DAPI + / CK + / CD45 − ، وتم تحديد كرات الدم البيضاء على أنها DAPI + / CK − / CD45 +. يوضح الشكل 6 الخلايا السرطانية للقولون والمستقيم المزروعة على شريحة القطع الناقص الكبيرة بعد التقاطها. يوضح الشكل 7 خلايا ورم القولون والمستقيم التي تم التقاطها على المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير. سريريا ، تم التقاط CTCs في دم المريض بواسطة رقائق موجية ، ومرشحات دقيقة شبه منحرف ، ومرشحات دقيقة كبيرة القطع الناقص ، مما يشير إلى أن هذه الرقائق الثلاثة ناجحة في التقاط CTCs. من المحتمل أن يتم تطبيقها في منتجات CTC ، مثل منتجات عزل CTC ، بكفاءة عالية.

Figure 1
الشكل 1: التقاط رقاقة الموجة. تم التقاط جميع الخلايا السرطانية ل MCF-7 حول مجموعة رقاقة الموجة دون فقدان أي خلايا. نظرا لعدم وجود أي خلايا سرطانية في أي منطقة أخرى إلى جانب المصفوفة ، فإن هذا يشير إلى كفاءة الالتقاط العالية للرقاقة. تم التقاط عدد كبير من الخلايا السرطانية. لذلك ، يمكن أيضا التقاط الخلايا السرطانية النادرة بسهولة. تم التقاط الخلايا السرطانية ل MCF-7 بواسطة رقاقة موجية و (A) ملطخة ب Hoechst و (B) ملطخة بالكالسيين AM. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: عينة سريرية ل CTCs تم التقاطها بواسطة المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الصغير. CTCs السريرية لمريض سرطان المعدة التي تم التقاطها بواسطة المرشحات الدقيقة القطع الناقص الصغيرة. تم تحديد CTCs في برايتفيلد ومع كل من مضان الأزرق والأخضر. تشير الدائرة الزرقاء في (A) إلى CTC لمريض سرطان المعدة الذي تم التقاطه داخل الشريحة. من الصور التي تم التقاطها ، يمكن ملاحظة أنه لم تكن هناك خلايا أخرى في أي مناطق أخرى ، مما يشير إلى أن نقاء الالتقاط كان مرتفعا لهذه الشريحة. تم التقاط الخلايا السرطانية ل MCF-7 بواسطة مرشحات مجهرية صغيرة القطع الناقص وشوهدت في (A) brightfield ، (B) ملطخة ب Hoechst ، و (C) ملطخة ب CK-FITC. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عينة سريرية من CTCs تم التقاطها بواسطة مرشحات مجهرية شبه منحرفة. تم التقاط CTCs السريرية من مريض سرطان القولون والمستقيم بواسطة المرشحات الدقيقة شبه المنحرفة. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة أنه تم التقاط ستة CTCs ، مما يشير إلى أن كفاءة الالتقاط كانت عالية في المجال الصغير. بالإضافة إلى ذلك ، لم تظهر أي خلايا أخرى ، مما يشير إلى أن نقاء الالتقاط كان مرتفعا للغاية لهذه الشريحة. تم التقاط الخلايا السرطانية ل MCF-7 بواسطة مرشحات دقيقة شبه منحرف وشوهدت في (A) brightfield ، (B) ملطخة ب Hoechst ، و (C) ملطخة ب CK-FITC. شريط المقياس: 20 ميكرومتر يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: ثقافة CTCs التي تم التقاطها بواسطة المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير. تم التقاط الخلايا السرطانية ل MCF-7 بواسطة مرشحات مجهرية بيضاوية كبيرة أمام مجموعة micropost ذات القطع الناقص الكبير. لم تمر أي خلايا سرطانية عبر المصفوفة ، مما يشير إلى كفاءة التقاط عالية لهذه الشريحة. بعد القبض ، نمت الخلايا السرطانية لمدة 24-48 ساعة. يشير هذا إلى أن كلا من كفاءة الالتقاط والقدرة على البقاء كانت عالية جدا بالنسبة للمرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير. تم التقاط الخلايا السرطانية المستزرعة ل MCF-7 بواسطة مرشحات دقيقة كبيرة القطع الناقص وشوهدت في (A) 0 h بعد الالتقاط ، (B) 24 ساعة بعد الالتقاط ، و (C) 48 ساعة بعد الالتقاط. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: مثال على عينة سريرية تستخدم لالتقاط CTC بواسطة مرشحات مجهرية شبه منحرفة. تم التقاط CTCs السريرية من مريض سرطان القولون والمستقيم بواسطة المرشحات الدقيقة شبه المنحرفة. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة أنه تم التقاط اثنين من CTCs ، مما يشير إلى كفاءة التقاط عالية. لم يكن هناك اضطراب آخر في الخلايا باستثناء بقايا كرات الدم الحمراء في الشريحة. وبالتالي ، من أجل المعالجة السريرية المسبقة لالتقاط CTC ، من الأفضل عدم استخدام تحلل خلايا الدم الحمراء. تم التقاط CTCs لسرطان القولون والمستقيم بواسطة مرشحات دقيقة شبه منحرف وشوهدت في (A) brightfield ، (B) ملطخة ب Hoechst ، (C) ملطخة ب CK-FITC ، و (D) شوهدت في الصور المدمجة. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مثال على CTCs المستزرعة التي تم التقاطها بواسطة شريحة القطع الناقص الكبيرة. مزارع الخلايا السرطانية لخلايا MCF-7 أمام مجموعة micropost ذات القطع الناقص الكبير وخلف المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير. نمت الخلايا السرطانية الملطخة بالكالسيين AM التي تنبعث منها مضان أخضر حسب الرغبة ، مما يشير إلى أن صلاحية الخلية لهذه الشريحة كانت عالية جدا. في المجموع ، كان هناك 15 صفيفا ، مع وجود فجوات متنوعة لكل مصفوفة منظمة بواسطة أعمدة مجهرية كبيرة القطع الناقص. تمت زراعة الخلايا السرطانية MCF-7 على شريحة القطع الناقص الكبيرة بعد التقاط (A) في مصفوفة واحدة و (B) في مجموعة أخرى. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: مثال على عينة سريرية تستخدم لالتقاط CTC بواسطة مرشحات مجهرية ذات قطع ناقص كبير. تم التقاط CTCs السريرية من مريض سرطان القولون والمستقيم بواسطة المرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير. من الصور ، يمكن ملاحظة أن هناك تلوث كرات الدم الحمراء. يشير هذا إلى أنه يجب تخفيف عينة دم المريض بالكامل وأن الشريحة تحتاج إلى شطفها بعد التقاطها. تم التقاط CTCs لعينات دم مرضى سرطان القولون والمستقيم السريري على شريحة القطع الناقص الكبيرة وشوهدت في (A) brightfield ، (B) ملطخة ب Hoechst ، و (C) ملطخة ب CK-FITC. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التشخيص والتشخيص المبكر للسرطان لهما تأثير كبير على علاج السرطان1. يوفر عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة خزعة سائلة بدون غزو. ومع ذلك ، فإن CTCs نادرة للغاية وغير متجانسة في الدم1 ، مما يجعل من الصعب عزل CTCs. CTCs لها خصائص مماثلة لمصادر الورم الأصلية التي نشأت منها. وبالتالي ، تلعب CTCs دورا حيويا في ورم خبيث للسرطان1.

يسمح البروتوكول المقترح بإجراء تحليل كامل لعزل CTC باستخدام رقاقة الموائع الدقيقة. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات الرئيسية المتعلقة بعزل CTC. على سبيل المثال ، يتضمن هذا البروتوكول تحليلات RBCL ، والتي يتم تسجيلها بدقة وتنظيمها في حزم مختلفة ، واكتساب الخلايا السرطانية النادرة ، وتحديد معدل التدفق الأمثل ، وكفاءة الالتقاط ، والتوصيف السريري ، والتعداد. تسهل الإدارة الدقيقة للعمليات معالجة عينات المريض السريرية. يسمح البروتوكول بالمعالجة المسبقة ومعالجة عينات المرضى السريرية ويقدم خدمات حيوية للأطباء.

بالنسبة لعزل CTC ، من الصعب للغاية إجراء المعالجة المسبقة للخلايا السرطانية النادرة. تم حل هذه الصعوبة باستخدام إبرة مجوفة يتم سحبها من خلال مجتذب إبرة لامتصاص 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 خلايا سرطانية حسب الرغبة. بعد ذلك ، تم تحضير عينة دم سريرية قريبة من الواقع مع العدد المطلوب من الخلايا السرطانية الممزوجة بالدم الطبيعي ، مما يحاكي عينة دم المريض. مع عينات دم المريض الاصطناعية هذه ، تم إجراء تجربة قريبة من الواقع. لقد حلت هذه الطريقة مشكلة صعبة يتم مواجهتها عادة في عزل CTC للتجارب المسبقة. وهذا النهج ليس من السهل تنفيذه ولم يبلغ عنه قط في أي مكان آخر؛ ومع ذلك ، فهو نهج مفيد قبل إجراء تجربة سريرية حقيقية.

يتم تصنيف عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة إلى ثلاثة أنواع: القائمة على التقارب ، والقائمة على المادية ، والقائمة على المناعة المغناطيسية. للعزل القائم على التقارب ، يجب تعديل رقاقة الموائع الدقيقة. تم تضمين إجراءات التعديل المحددة للتعديل باستخدام مضاد EpCAM. تم تحديد CTCs من خلال تلطيخ التألق المناعي مع Hoechst و CK-FITC و CD45-PE. نظرا لأن العديد من الخلايا السرطانية تعبر عن EpCAM ، فإن anti-EpCAM هو جسم مضاد مهم لالتقاط CTCs في دم المريض. ومع ذلك ، فإن مكافحة EpCAM مكلفة للغاية. وبالتالي ، تم تطوير العديد من aptamers لحل هذه المشكلة. نحن نستخدم بشكل أساسي رقائق الموائع الدقيقة الفيزيائية مثل المرشحات الدقيقة الصغيرة القطع الناقص والمرشحات الدقيقة شبه المنحرفة لالتقاط CTCs لأنها بسيطة وسهلة التشغيل وفعالة.

تتمثل ميزة هذه التقنية على التقنيات البديلة في أن الرقاقة المادية للمرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير تلتقط بقوة CTCs بكفاءة التقاط عالية. والسبب في ذلك هو أن هناك أنفاق ضئيلة من فجوات خط الخط. تلتقط رقائق الموجة CTCs من خلال الجمع بين كل من العزلة القائمة على الملكية المادية والقائمة على التقارب. يتم التقاط CTCs بواسطة الفجوات الصغيرة ، ويمكن استخدام الفجوات الكبيرة لتسريع معدل التدفق. يجب أن تمر CTCs المفقودة عبر الفجوات الصغيرة في المصفوفات التالية ويتم التقاطها أيضا من خلال العزلة القائمة على التقارب.

لقد حل البروتوكول العديد من المشكلات الرئيسية في عزل CTC ، خاصة بالنسبة للتجارب السريرية. ومع ذلك ، من المستحيل تضمين كل خطوة مفصلة في عزل CTC ، مثل ما يتعلق بدور الجسيمات النانوية والهياكل النانوية وتعديل الأبتامير. وتؤدي هذه الجوانب أيضا دورا أساسيا في عزلة لجنة مكافحة الإرهاب. ومع ذلك ، فهي ليست حاسمة في حل مشاكل مثل تحسين كفاءة الالتقاط. وبدلا من ذلك، تثري هذه الجوانب عزلة لجنة مكافحة الإرهاب بمحتويات جديدة.

يركز هذا العمل على العزل السريري ل CTCs باستخدام شريحة الموائع الدقيقة المصممة. معظم رقائق الموائع الدقيقة المستخدمة تعتمد بشكل أساسي على المادية، مثل مرشحات القطع الناقص الكبير ومرشحات القطع الناقص الصغيرة. تصنع رقائق الموجة من خلال الجمع بين خصائص الرقاقة القائمة على التقارب والفيزيائية1. تم تصميم الأعمدة الدقيقة للمرشحات ذات القطع الناقص الكبير لتكون أقصر لتعزيز نقاء الالتقاط في هذا العمل. يمكن أيضا تحسين مرشحات القطع الناقص الصغيرة من خلال تصميمها بأحجام micropost متنوعة لمصفوفات مختلفة. يمكن تصميم رقائق الموجة بشكل أفضل عن طريق إضافة المزيد من المصفوفات لتحسين الالتقاط.

يتم تنظيم مرشحات القطع الناقص الكبيرة باستخدام أعمدة مجهرية بيضاوية طويلة لتشكيل أنفاق خط الخط التي تحقق كفاءة التقاط عالية. ومع ذلك ، فإن الحد من هذا الالتقاط هو أن نقاء الالتقاط ليس مرتفعا بدرجة كافية أو لا يمكن الحصول على نقاء التقاط عالي بسهولة. بالنسبة لرقاقة الموجة ، يتم استخدام الفجوات الصغيرة لالتقاط CTCs ، ويتم التقاط CTCs المفقودة بواسطة المصفوفات التالية. تستخدم الفجوات الكبيرة لتسريع معدل التدفق والقضاء على الاضطراب من كرات الدم الحمراء ، وبالتالي تحسين نقاء الالتقاط ؛ ومع ذلك ، فإن كفاءة الالتقاط صلبة عند أعلى من 90٪ وقابلة للتكرار.

التحقق السريري مهم في عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة. يقدم هذا العمل العزلة السريرية ل CTCs من مرضى القولون والمستقيم باستخدام مرشحات القطع الناقص الكبيرة ومرشحات القطع الناقص الصغيرة ورقائق الموجة. الهدف من رقائق الموائع الدقيقة المصممة هو تعداد CTCs سريريا. بالنسبة للطرق الحالية لبعض الأنظمة أو المنصات الأخرى ، تكون كفاءة الالتقاط منخفضة ، أو أن كفاءة الالتقاط ليست عالية بما يكفي لاستخدام الطريقة بفعالية في التطبيقات السريرية.

استنادا إلى الأداء السريري لهذه الرقائق الدقيقة الثلاثة ، والتي تتمتع بكفاءة التقاط عالية ، يمكن تطبيقها في منتجات CTC ، خاصة بعد التعديل. تكمن قوة بروتوكولنا في أنه يوضح تعداد عدد نادر من الخلايا السرطانية لتقليد العينات السريرية الحقيقية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإجراء التجريبي السريري ممكن وعملي. يمكن لهذه الطريقة فصل CTCs عن دم المريض الكامل. لذلك ، فإن الطريقة مناسبة للتطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل البحثي من قبل مؤسسة آنهوي للعلوم الطبيعية في الصين (1908085MF197 ، 1908085QB66) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21904003) ، ومشروع البحث العلمي للجنة تيانجين التعليمية (2018KJ154) ، وبرنامج أبحاث العلوم الطبيعية الإقليمي لمؤسسات التعليم العالي في مقاطعة آنهوي (KJ2020A0239) ، ومختبر شنغهاي الرئيسي لمعالجة المعلومات متعددة الأبعاد ، مختبر شرق الصين الرئيسي للمعلومات متعددة الأبعاد المعالجة ، جامعة شرق الصين للمعلمين (MIP20221).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
  2. World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
  4. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  5. Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
  6. Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
  7. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  8. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  9. Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
  10. Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
  11. Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
  12. Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
  13. Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
  14. Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
  15. Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
  16. Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
  17. Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
  18. Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 200 ، رقاقة الموائع الدقيقة ، الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) ، تحديد التألق المناعي
منصة رقاقة الموائع الدقيقة السريرية لعزل الخلايا السرطانية المنتشرة متعددة الاستخدامات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y.,… More

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter