Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

Summary

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Abstract

Das Aufkommen von granularen Hydrogelgerüsten (GHS), die durch die Assemblierung von Hydrogel-Mikropartikeln (HMPs) hergestellt werden, hat die Bildung von mikroporösen Gerüsten in situ ermöglicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Bulk-Hydrogelen erleichtern miteinander verbundene mikroskalige Poren in GHS die abbauunabhängige Zellinfiltration sowie den Transfer von Sauerstoff, Nährstoffen und zellulären Nebenprodukten. Methacryloyl-modifizierte Gelatine (GelMA), ein (photo)chemisch vernetzbares, proteinbasiertes Biopolymer, das Zellklebstoff und biologisch abbaubare Einheiten enthält, wird häufig als zellresponsives/instruktives Biomaterial verwendet. Die Umwandlung von GelMA in GHS kann eine Fülle von Möglichkeiten für das Tissue Engineering und die Regeneration eröffnen. In diesem Artikel demonstrieren wir die Verfahren der Hochdurchsatz-GelMA-Mikrogelherstellung, der Umwandlung in resuspendierbare trockene Mikrogele (Mikro-Aerogele), der GHS-Bildung durch die chemische Assemblierung von Mikrogelen und der granularen Biotintenherstellung für das Extrusions-Bioprinting. Wir zeigen, wie eine sequentielle physikalisch-chemische Behandlung durch Kühlung und Photovernetzung die Bildung von mechanisch robustem GHS ermöglicht. Wenn Licht nicht zugänglich ist (z. B. während der Tiefengewebsinjektion), können individuell vernetzte GelMA-HMPs durch enzymatische Vernetzung unter Verwendung von Transglutaminasen bioorthogonal zusammengesetzt werden. Schließlich wird das dreidimensionale (3D) Bioprinting von mikroporösem GHS bei niedriger HMP-Packungsdichte über die Grenzflächen-Selbstorganisation heterogen geladener Nanopartikel demonstriert.

Introduction

Der Zusammenbau von HMP-Bausteinen zu Tissue-Engineering-Gerüsten hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erregt¹. GHS, die durch HMP-Assemblierung hergestellt werden, haben im Vergleich zu ihren Gegenstücken einzigartige Eigenschaften, einschließlich der Mikroporosität im Zellmaßstab, die von den Hohlräumen zwischen den diskreten Bausteinen herrührt. Zusätzliche Eigenschaften wie Injektionsfähigkeit, Modularität und entkoppelte Steifigkeit von Porosität machen GHS zu einer vielversprechenden Plattform zur Verbesserung der Gewebereparatur und -regeneration². Für die GHS-Herstellung wurden verschiedene Bi....

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. GelMA-Synthese

HINWEIS: Die GelMA-Synthese sollte in einem chemischen Abzug durchgeführt werden, und es sollte ständig geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden.

1. 200 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1x) von Dulbecco werden in einen Erlenmeyerkolben gegeben und die Lösung erhitzt, bis sie 50 °C erreicht. Decken Sie den Kolben mit Alufolie ab, um Verdunstung zu verhindern.
2. 20 g Gel....

Results

GelMA wurde durch die Reaktion von Gelatine mit MA synthetisiert, wie in Abbildung 1A dargestellt. Durch Anpassung der Reaktionsbedingungen, wie z.B. der MA-Konzentration, wurden unterschiedliche Grade der MA-Substitution erhalten. Um den Grad der MA-Substitution zu quantifizieren, wurde GelMA mittels 1-H-NMR-Spektroskopie bewertet (Abbildung 1B). Vinylfunktionelle Gruppen mit repräsentativen Peaks bei den chemischen Verschiebungen von ~5-6 p.......

Discussion

Gelatine und ihre Derivate sind die am häufigsten verwendeten proteinbasierten Biomaterialien für die HMP-Herstellung. Die Herausforderung des Kompromisses zwischen Durchsatz und Partikelgröße kann mit mikrofluidischen Geräten zur Stufenemulgierung überwunden werden. Diese Geräte sind in der Lage, mehr als 40 Millionen Tröpfchen pro Stunde zu bilden, mit einem Variationskoeffizienten von weniger als 5%²⁷. In diesem Artikel haben wir die Mikrofabrikation von Tröpfchen, die GelMA-Lösungen enthalten,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% Reinheit
Biopsiestempel	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1,5 mm Biopsiestempel mit Kolbensystem
Stumpfe Nadel	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400	MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR Gerät
Zentrifuge	Eppendorf, Deutschland	5415 C
Zentrifugenröhrchen	Celltreat, MA ,USA	229423
Kaffeefilter	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Tassen Kaffeefilter, je 6, 100 ct
Exsikkator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vakuum-Exsikkator, PC-Abdeckung und Gehäuse, 280 mm
AD Deuteriumoxid	Sigma, MA, USA	151882
Dialysemembran (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	trockenes Pulver, ohne Calcium, ohne Magnesium, geeignet für Zellkultur
Erlenmeyerkolben	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Ethanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
Kryofläschchen mit Außengewinde (Kryovials)	Corning, NY, USA	430659
Gefriertrockner	Labconco, MO, USA	71042000	Ausgestattet mit Vakuumpumpe (Katalog# 7587000)
Gelatinepulver	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Typ A aus Schweinehaut, Gelstärke ~300 g Bloom
Glass Objektträger	VWR, PA, USA	82027-788
Heizplatte	FOUR E'S SCIENTIFIC		5 Zoll Magnetischer Heizplattenrührer Max Temp 280 ° C/536 ° F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 Negativ-Fotolack-Serie	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 und KMP1035 sind enthalten
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok Steckverbinder	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜ SS MicroTeck, Deutsches		Nanofabrikationsgerät
Methacylanhydrid	Sigma, MA, USA	276685-100ML	enthält 2.000  ppm Topanol A als Inhibitor, 94%
Milli-Q Wasser	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	elektrischer Widerstand ≈ 18 MΩ bei 25 &Grad; C, Direct-Q 5 UV-Fernreinigungssystem
Novec 7500 technische Flüssigkeit	3M, MN, USA		3M ID  7100003723
Ofen	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Vakuumschrank
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pasteurpipette	VWR, PA, USA	14673-010
Petrischale	VWR, PA,	USA 25384-092	Polystyrol
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pipettenspitzen	VWR, PA, USA	87006-060
Plasmareinigungskammer	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polydimethylsiloxan	Dow Corning, MI, Vereinigte Staaten von Amerika	2065623	SYLGARD 184 Silikonelastomer-Kit
Direktverdrängerpipette	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Siliziumwafer	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-Zoll-Spatel in mechanischer Qualität
	VWR, PA, USA	231-0104
Einweg-SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Spritzenpumpe	Harvard Apparat, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon Schläuche	Saint-Globain, PA, USA	AAD04103
UV-Licht	QUANS		Spannung: 85 V-265 V AC / Leistung: 20 W
Vakuumfiltrationseinheit	VWR, PA, USA	10040-460	0,20 µ m
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini-Vortex-Mischer