Summary

Zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석

Published: January 06, 2023
doi:

Summary

이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주의 세포독성 평가에 적합한 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(Alamar Blue[AB], CFDA-AM, Neutral Red 및 MTT 분석)을 제시합니다.

Abstract

어류 세포주는 생태 독성 연구에 점점 더 많이 사용되고 있으며, 어류 급성 독성을 예측하는 방법으로 세포 독성 분석이 제안되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬(Danio rerio) 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주에서 세포 생존율을 평가하기 위해 수정된 세포독성 분석을 제시합니다. 평가된 세포독성 종점은 미토콘드리아 완전성(Alamar Blue[AB] 및 MTT 분석), 에스테라아제 활성을 통한 막 완전성(CFDA-AM 분석) 및 리소좀 막 완전성(Neutral Red[NR] 분석)입니다. 96-웰 플레이트에서 시험 물질을 노출시킨 후, 세포독성 분석이 수행되고; 여기서, AB 및 CFDA-AM은 동시에 수행되고, 동일한 플레이트에서 NR이 수행되고, MTT 분석은 별도의 플레이트에서 수행된다. 이러한 분석에 대한 판독값은 AB 및 CFDA-AM에 대한 형광과 MTT 및 NR에 대한 흡광도로 측정됩니다. 이러한 어류 세포주로 수행된 세포독성 분석은 어류에 대한 화학 물질의 급성 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

화학 물질은 인체 건강 및 환경에 대한 안전성에 대해 테스트해야합니다. 분자 및 세포 바이오마커는 생체 내 부작용(예: 분비 교란, 면역학적 반응, 급성 독성, 광독성)3,4,5,6,7 에 선행할 수 있기 때문에 규제 기관 및/또는 법률(예: REACH, OECD, US EPA)에 의해 살아있는 유기체 대한 영향을 예측하기 위한 안전성 평가에서 점점 더 많이 고려되고 있습니다 . 이러한 맥락에서, 세포 독성은 어류 급성 독성을 예측하기위한 측정으로 취해졌다 5,8; 그러나 어류에 대한 가장 다양한 영향 (예 : 내분비 교란 효과)을 연구하기 위해 화학 물질의 아 세포 독성 농도를 정의하는 것과 같은 생태 독성 연구에서 많은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있습니다.

세포 배양 시스템 (시험관 내 시스템)에서 화학 물질의 세포 독성은 종점 유형이 다른 방법으로 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 세포독성 방법은 세포 사멸 과정 동안 관찰된 특정 형태와 관련된 종말점을 기반으로 할 수 있는 반면, 다른 방법은 세포 사멸, 생존력 및 기능, 형태, 에너지 대사, 세포 부착 및 증식의 측정에 의해 세포독성을 결정할 수 있습니다. 화학 물질은 다양한 메커니즘을 통해 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있으므로 화학적 효과를 예측하기 위해서는 다양한 세포 생존 종점을 포괄하는 세포 독성 평가가 필요하다9.

MTT 및 Alamar Blue(AB)는 세포 대사 활성에 따라 세포 생존율에 미치는 영향을 결정하는 분석법입니다. 상기 MTT 분석은 미토콘드리아 효소인 숙시네이트 탈수소효소10의 활성을 평가한다. 황색을 띤 3-[4,5-디메틸티아졸-2일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)가 포르마잔 블루로 환원되는 것은 생존 세포에서만 발생하며, 광학 밀도는 생존 세포 수에 정비례한다(10). AB 분석은 살아있는 세포에 의해 레사주린을 레소루핀으로 환원시킬 때 형광을 발하고 색을 변화시키는 미토콘드리아 효소에 의해 매개되는 민감한 산화-환원 지표입니다11; 그러나 세포질 및 마이크로솜 효소도 AB 및 MTT12의 감소에 기여합니다. 이러한 효소에는 알코올 및 알데히드 산화환원효소, NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소, 플라빈 환원효소, NADH 탈수소효소 및 시토크롬과 같은 여러 환원효소가 포함될 수 있다11.

중성 적색(NR) 분석은 이 염료를 생존 세포의 리소좀에 혼입시키는 것을 기초로 하는 세포 생존율 분석이다13. NR의 흡수는 pH 구배를 유지하는 세포의 능력에 달려 있습니다. 리소좀 내부의 양성자 구배는 세포질보다 낮은 pH를 유지합니다. 정상적인 생리학적 pH에서 NR은 세포막을 투과할 수 있는 약 0의 순 전하를 나타냅니다. 따라서 염료는 전하를 띠고 리소좀 내부에 유지됩니다. 결과적으로, 잔류 NR의 양이 많을수록, 생존 가능한 세포(14)의 수가 많아진다. 세포 표면이나 리소좀 막을 손상시키는 화학 물질은이 염료의 흡수를 손상시킵니다.

CFDA-AM 분석은 5-카르복시플루오레세인 디아세테이트 아세톡시메틸 에스테르(CFDA-AM)15의 보존을 기반으로 하는 형광 측정 세포 생존율 분석법입니다. 에스테라제 기질인 5-CFDA-AM은 살아있는 세포의 막에 의해 극성이고 불투과성인 형광 물질인 카르복시플루오레세인으로 전환됩니다15; 따라서 손상되지 않은 세포막의 안쪽에 유지되어 생존 가능한 세포를 나타냅니다.

최근에는 검증된 ISO(국제표준화기구) 가이드라인(ISO 21115:2019)16 및 OECD(경제협력개발기구) 시험법(OECD TG 249)에서 3가지 세포독성 분석법(CFDA-AM, NR, AB 분석법)을 결합하여 24웰 플레이트에서 RTgill-W1 세포주(무지개 송어[Oncorhynchus mykiss] 아가미의 영구 세포주)를 사용하여 어류 급성 독성을 평가했습니다17 . 어류의 급성 독성을 예측하는 기존의 세포 기반 방법이 있지만 다른 어종과 유사한 방법을 개발하고 방법의 처리량을 늘리기 위해 노력했습니다. 몇 가지 예로는 특정 독성 경로18,19에 대한 리포터 유전자로 형질감염된 ZFL 세포주의 개발, RTgill-W1 세포주에서의 광독성 테스트(20), ZFL 및 ZF4 세포주(1일 된 배아에서 유래한 제브라피쉬 섬유아세포)의 사용을 포함하여 여러 세포독성 분석에 의한 독성을 평가한다21.

Danio rerio (제브라 피쉬)는 수생 독성 연구에 사용되는 주요 어종 중 하나입니다. 따라서 어류 독성 테스트를 위해 제브라피쉬 세포주를 사용한 세포 기반 방법이 매우 유용할 수 있습니다. ZFL 세포주는 간 실질 세포의 주요 특징을 나타내며 생체 이물을 대사할 수 있는 제브라피쉬 상피 간세포 세포주입니다 7,22,23,24,25. 한편, ZEM2S 세포주는 어류26,27에 대한 발달 효과를 조사하는 데 사용할 수 있는 배아 배반포 단계에서 유래한 배아 제브라피쉬 섬유아세포 세포주입니다. 따라서 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주로 수행할 수정과 함께 4가지 세포독성 분석(MTT, AB, NR 및 CFDA-AM 분석)을 설명합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜에 사용된 재료 목록은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 매체의 구성은 표 1 을 참조하십시오. 1. ZFL 및 ZEM2S 세포 준비 80% 합류도를 갖는 ZFL 또는 ZEM2S 세포의 T75 플라스크로 시작하여,CO2 없이 28°C에서 각각의 완전한 배지에서 배양하였다. 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 10mL?…

Representative Results

그림 3은 AB, CFDA-AM, NR 및 MTT 분석의 플레이트를 보여줍니다. AB 분석(그림 3A)의 경우, 생존 세포가 없거나 감소된 블랭크 웰 및 웰은 청색과 낮은 형광을 나타내는 반면, 생존 세포 수가 많은 웰은 분홍빛을 띠고 생존 세포에 의해 레사주린(AB)이 레소루핀(분홍빛이 도는 물질)으로 변환되어 높은 형광 값을 나타냅니다. CFDA-AM 분석의 경우 플레이트의 웰 색…

Discussion

세포독성 분석은 시험관 내 독성 평가에 널리 사용되며, 이 프로토콜 기사에서는 제브라피쉬 세포주에서 수행되도록 변형된 4가지 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(즉, 96웰 플레이트의 세포 밀도, MTT 분석의 배양 시간, 화학 노출 조건 동안의 FBS 고갈 및 SC에 대한 최대 허용 농도)을 제시합니다. 이러한 분석은 다양한 세포 생존 종점(대사 기능, 리소좀 막 무결성 및 세포막 무결성)에 의?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성에 대한 생리학과 (UFPR)의 다중 사용자 실험실과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticario의 재정 지원에 감사드립니다.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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Diesen Artikel zitieren
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).

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