Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.
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Methodenartikel
Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fischzelllinien werden zunehmend in Ökotoxizitätsstudien verwendet, und Zytotoxizitätstests wurden als Methoden zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen vorgeschlagen. Daher enthält dieses Protokoll Zytotoxizitätsassays, die modifiziert wurden, um die Zelllebensfähigkeit in Zebrafisch- (Danio rerio), Embryo- (ZEM2S) und Leber- (ZFL) Zelllinien in 96-Well-Platten zu bewerten. Die bewerteten Endpunkte der Zytotoxizität sind die mitochondriale Integrität (Alamar Blue [AB]- und MTT-Assays), die Membranintegrität über die Esteraseaktivität (CFDA-AM-Assay) und die lysosomale Membranintegrität (Neutral Red [NR]-Assay). Nach der Exposition der Testsubstanzen in einer 96-Well-Platte werden die Zytotoxizitätstests durchgeführt; Hier werden AB und CFDA-AM gleichzeitig durchgeführt, gefolgt von NR auf derselben Platte, während der MTT-Assay auf einer separaten Platte durchgeführt wird. Die Messwerte für diese Assays werden durch Fluoreszenz für AB und CFDA-AM und Absorption für MTT und NR ermittelt. Die mit diesen Fischzelllinien durchgeführten Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die akute Toxizität chemischer Substanzen an Fischen zu untersuchen.
Einleitung
Chemische Stoffe müssen auf ihre Sicherheit für die menschliche Gesundheit und die Umwelt geprüft werden. Molekulare und zelluläre Biomarker werden zunehmend in Sicherheitsbewertungen zur Vorhersage von Auswirkungen auf lebende Organismen durch Regulierungsbehörden und/oder Gesetzgebungen (z. B. REACH, OECD, US-EPA)1,2 berücksichtigt, da sie dem unerwünschten In-vivo-Ergebnis (z. B. endokrine Störung, immunologische Reaktion, akute Toxizität, Phototoxizität) vorausgehen können3,4,5,6,7
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Protokoll
ANMERKUNG: In der Materialtabelle finden Sie die Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und in Tabelle 1 die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien.
1. Vorbereitung von ZFL- und ZEM2S-Zellen
- Beginnen Sie mit einem T75-Kolben aus ZFL- oder ZEM2S-Zellen mit 80% Konfluenz, kultiviert im jeweiligen vollständigen Medium bei 28 °C ohne CO2.
- Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen unter Zugabe von 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M). 3 ml 1x Trypsin (0,05% v/v; 0,5 mM T....
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Ergebnisse
Abbildung 3 zeigt die Platten der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Für den AB-Assay (Abbildung 3A) zeigen die Blindvertiefungen und Vertiefungen ohne oder mit einer reduzierten Anzahl lebensfähiger Zellen eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, während die Vertiefungen mit einer hohen Anzahl lebensfähiger Zellen rosa sind und aufgrund der Umwandlung von Resazurin (AB) in Resorufin (rosafarbene Substanz) durch die lebensfähigen Zellen hohe Fluoreszenzwer.......
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Diskussion
Zytotoxizitätstests werden häufig für die In-vitro-Toxizitätsbewertung verwendet, und in diesem Protokollartikel werden vier häufig verwendete Zytotoxizitätstests vorgestellt, die für die Durchführung in Zebrafischzelllinien modifiziert wurden (d. h. Zelldichte für 96-Well-Platten, Inkubationszeit im MTT-Assay, FBS-Erschöpfung während der chemischen Expositionsbedingungen und maximal akzeptable Konzentration für die SC). Da diese Assays die Zytotoxizität anhand verschiedener Endpunkte der Zelllebensfähigkeit (S.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
In Erinnerung an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finanzcode 001) und der Grupo Boticario.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluoresceindiacetat, Acetoxymethylester) | Invitrogen | C1345 | |
| Zellkulturplatte, 96-Well-Platte | Sarstedt | 83.3924 | Oberfläche: Standard, flache Basis |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Pulver, hoher Glukosegehalt, Pyruvat |
| FBS - Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, Pulver | Gibco | 21700026 | Pulver |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Pulver |
| Neutral rot | Sigma-Aldrich | N4638 | Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen |
| Orbitalschüttler | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm Rotationsdurchmesser |
| Dulbeccos PBS (10X) mit Calcium und Magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin Natriumsalz | Sigma-Aldrich | R7017 | Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Pulver |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | Pulver Bioreagenz für die Molekularbiologie |
| Thiazolylblau, Tetrazoliumbromid 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypanblau-Färbung (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S Zelllinie | ATCC | CRL-2147 | Diese Zelllinie wurde freundlicherweise von Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL Zelllinie | BCRJ | 256 |
Referenzen
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
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Nachdrucke und Genehmigungen
