Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie
Summary
Hier beschrijven we een op immunofluorescentie gebaseerde methode om de niveaus van enkelstrengs DNA in cellen te kwantificeren. Deze efficiënte en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om replicatiestress te onderzoeken, een gemeenschappelijk kenmerk bij verschillende eierstokkankers. Bovendien is deze test compatibel met een geautomatiseerde analysepijplijn, wat de efficiëntie verder verhoogt.
Abstract
Replicatiestress is een kenmerk van verschillende eierstokkankers. Replicatiestress kan voortkomen uit meerdere bronnen, waaronder dubbelstrengsbreuken, transcriptie-replicatieconflicten of versterkte oncogenen, wat onvermijdelijk resulteert in het genereren van enkelstrengs DNA (ssDNA). Het kwantificeren van ssDNA biedt daarom een kans om het niveau van replicatiestress in verschillende celtypen en onder verschillende DNA-beschadigende omstandigheden of behandelingen te beoordelen. Opkomend bewijs suggereert ook dat ssDNA een voorspeller kan zijn van reacties op chemotherapeutische geneesmiddelen die gericht zijn op DNA-reparatie. Hier beschrijven we een gedetailleerde immunofluorescentie-gebaseerde methodologie om ssDNA te kwantificeren. Deze methodologie omvat het labelen van het genoom met een thymidine-analoog, gevolgd door de op antilichamen gebaseerde detectie van het analoog bij het chromatine onder niet-denaturerende omstandigheden. Stukken ssDNA kunnen worden gevisualiseerd als foci onder een fluorescentiemicroscoop. Het aantal en de intensiteit van de foci houden direct verband met het niveau van ssDNA dat in de kern aanwezig is. We beschrijven ook een geautomatiseerde pijplijn om het ssDNA-signaal te kwantificeren. De methode is snel en reproduceerbaar. Bovendien maakt de eenvoud van deze methodologie het vatbaar voor toepassingen met een hoge doorvoer, zoals medicijn- en genetische schermen.
Introduction
Genomisch DNA wordt vaak blootgesteld aan meerdere aanvallen van verschillende endogene en exogene bronnen1. De frequentie van endogene schade correleert direct met de niveaus van metabole bijproducten, zoals reactieve zuurstofsoorten of aldehyden, die intrinsiek hoger zijn bij meerdere soorten kanker, waaronder eierstokkanker 2,3. Het is absoluut noodzakelijk dat DNA-schade efficiënt wordt opgelost; Anders kan het genotoxische laesies en bijgevolg mutagenese bevorderen. Het vermogen van cellen om genotoxische laesies te repareren is afhankelijk van de functionaliteit van foutloze DNA-reparatieroutes en de efficiënte regulatie van celcyclusprogressie als reactie op DNA-schade. Met name veel eierstokkankers dragen functioneel inactiverende mutaties in p53 en hebben dus een defect G1 / S-controlepunt, waardoor de cellen DNA-replicatie initiëren ondanks de aanwezigheid van niet-herstelde genomische laesies 4,5. De mate van DNA-schade bij eierstokkanker wordt verder verergerd door de observatie dat meer dan 50% van de hooggradige sereuze ovariumcarcinomen (HGSOC) defecten hebben in BRCA1- en BRCA2-gemedieerde homologe recombinatie, de foutloze DNA-reparatieroute, en ongeveer 20% heeft amplificatie in het gen CCNE1, dat G1-cellen voortijdig in de S-fase6 duwt . Samen verbeteren de hoge frequentie van endogene DNA-schade, defecte controlepunten en slecht functionerende reparatieroutes exponentieel de accumulatie van genomische laesies bij eierstokkanker. Deze laesies kunnen dienen als belemmeringen voor de progressie van kritieke cellulaire processen zoals DNA-replicatie en transcriptie. Zoals hieronder besproken, katalyseren dergelijke belemmeringen de generatie van enkelstrengs DNA (ssDNA) in cellen.
De dubbele helix van DNA is van cruciaal belang voor het beschermen van het genoom tegen meerdere mutagene processen, zoals spontane depurinatie en depyrimidinatie, de activiteit van cytosinedeaminasen en oxidatieve DNA-schade 1,7. Daarentegen is ssDNA zeer kwetsbaar voor deze mutatiegebeurtenissen. Meerdere processen in cellen kunnen resulteren in het genereren van ssDNA (figuur 1). Deze omvatten het volgende:
(i) Stilstand van de DNA-replicatiemachinerie: Dit leidt tot een ontkoppeling van de DNA-helicase en polymerase, waardoor stukken ssDNA 8,9 overblijven.
(ii) Stalling van de transcriptiemachinerie: Persistent stalling van RNA-polymerase leidt tot de generatie van driestrengs hybride DNA / RNA-structuren die R-lussen worden genoemd. R-lusvorming legt het verplaatste, niet-getranscribeerde DNA bloot als een enkele streng10.
(iii) DNA-eindresectie: Het initiëren van homologie-gericht herstel vereist het genereren van een 3′ ssDNA om de zoektocht naar een homologe sequentie11 te katalyseren.
(iv) D-lus: Strenginvasie tijdens homologe recombinatie kan resulteren in de verplaatsing van de niet-template complementaire streng, resulterend in ssDNA12.
(v) Replicatie-gekoppelde hiaten: Tijdens DNA-replicatie vindt achterblijvende strengsynthese op een discontinue manier plaats, waarbij Okazaki-fragmenten eerst worden gegenereerd en vervolgens geligeerd. Een vertraging of defect in de verwerking van de Okazaki-fragmenten kan ook leiden tot ssDNA-vorming. Ten slotte, als de replicatievork op een leidende streng een stagnerende laesie, DNA-polymerase en primase tegenkomt, kan PRIMPOL de synthese stroomafwaarts herprimeren, waardoor een ssDNA-kloof achterblijft van13,14.
Het is duidelijk dat de meeste van deze gebeurtenissen plaatsvinden wanneer de DNA-replicatiemachinerie wordt geconfronteerd met genomische laesies of tijdens replicatie-gekoppelde reparatie, wat suggereert dat hogere DNA-schade leidt tot verhoogde niveaus van ssDNA. Omdat veel van deze gebeurtenissen replicatie-geassocieerd zijn, wordt de vorming van ssDNA beschouwd als de marker van “replicatiestress” in cellen15,16.
Hier beschrijven we een test die kan worden gebruikt om ssDNA in cellen betrouwbaar te kwantificeren. De eenvoud, reproduceerbaarheid en kostenvoordelen van deze aanpak maken het geschikt om te worden gebruikt voor het beoordelen van de replicatie-stressrespons in cellen. Opkomende studies hebben aangetoond dat het niveau van ssDNA ook een voorspeller kan zijn van reacties op chemotherapie, zoals remmers van PARP1/2-enzymen, ATR en Wee1-kinase 17,18,19,20,21. Deze remmers worden nagestreefd in het behandelingsregime van verschillende HGSOC’s22. Daarom kan deze test ook een nuttig hulpmiddel zijn om chemotherapeutische reacties in eierstokkankercellen te voorspellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals vermeld in het protocol, is het waardevol om een paar experimentele controles op te nemen om ervoor te zorgen dat de test werkt. Deze omvatten een geen IdU behandeld monster en een geen primair antilichaam behandeld monster. Beide negatieve controles moeten cellen opleveren die zijn gekleurd door DAPI, maar geen IdU-signaal bevatten.
Op basis van de experimentele omstandigheden en de gebruikte cellijnen kunnen verschillende antilichaamverdunningen nodig zijn om het beste fluorescerende s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV wordt ondersteund door de Inaugural Pedal the Cause Grant van het Alvin J. Siteman Cancer Center via The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant van Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant van Mary Kay Ash Foundation en V-Foundation. NR wordt ondersteund door de NIH Cell and Molecular Biology training T32-beurs aan de Washington University, St. Louis.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
Referenzen
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D’Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -. M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA’s first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
