Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.
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Methodenartikel
Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.
Einleitung
Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wo....
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Protokoll
1. Medienaufbereitung
- Bereiten Sie 10 ml Kontroll- und überschüssige AAAs in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 %D2Ovor.
- Für die Kontrollmedien werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) in einem konischen 15-ml-Röhrchen gemessen und gemischt. Das DMEM-Pulver enthält alle Aminosäuren in Standardkonzentrationen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Fügen Sie 4,7 mlD2O, 0,5 ml fötales Kälberserum (5 % FBS) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) hinzu. Wirbeln Sie das Röhrchen gr....
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Ergebnisse
Die Zugabe von überschüssigen AAAs in 15-facher Konzentration zu den 50%D2O-haltigenZellkulturmedien führte zu deutlichen C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine in HeLa-Zellen (Abbildung 2B). Frühere Experimente wurden mit unterschiedlichen Konzentrationsniveaus durchgeführt, z. B. 2x und 5x, und obwohl die Daten nicht präsentiert werden, erzeugte die 15-fache Konzentration die deutlichsten C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine. Insbesondere du.......
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Diskussion
DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie, .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 mL Serologische Pipetten | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16 % Formaldehyd, methanolfrei | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-Well-Platte | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Spritzenvorsatzfilter, 2 μ m PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter | Cube Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| Netzteile des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Stromversorgung des | |
| Laser-Bandpassfilters | KR Electronics | KR2724 8 | MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Kabel | Thorlabs | 2249-C | Koaxialkabel, BNC Stecker/Stecker |
| Breitband Dielektrischer Spiegel | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Zentrifuge | |||
| Kondensator | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| Gleichstromnetzteil | TopWard | 6302D | |
| Dichroitische Halterung | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethylsulfoxid Zellkulturreagenz | mpbio | 196055 | |
| Dulbecco's Modified Eagle" s Medium ohne Methionin, Threonin und Natriumpyruvat | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Mit Natriumbicarbonat und ohne Methionin, Threonin und Natriumpyruvat |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ ImageJ | Version 1.53t 24. August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Schweres Wasser (Deuteriumoxid) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hämozymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds |
| Bandpassfilter mit hohem Außendurchmesser | Chroma-Technologie | ET890/220m | Filtert den Stokes-Strahl und sendet den Pumpstrahl |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0,25 % (1x) Lösung | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integriertes SRS-Lasersystem | Angewandte Physik & Elektronik, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD liefert einen Ausgangsimpuls bei 1031 nm mit einer Pulsbreite von 6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz, der als Stokes-Strahl dient. Der frequenzverdoppelte Strahl bei 532 nm wird verwendet, um einen Pikosekunden-Optisch-Parametrischen Oszillator (OPO) synchron zu säen, um eine modengekoppelte Impulsfolge mit einer Pulsbreite von fünf ~ 6 ps zu erzeugen (der Leerlaufstrahl des OPO wird mit einem interferometrischen Filter blockiert). Die Ausgangswellenlänge des OPO ist ab 720– 950 nm, der als Pumpstrahl dient. Die Intensität des 1031 nm Stokes Strahls wird durch ein eingebautes EOM bei 8 MHz mit einer Modulationstiefe von mehr als 90% sinusförmig moduliert. Der Pumpstrahl wird räumlich mit dem Stokes-Strahl überlappt, indem ein dichroitischer Spiegel im Inneren von picoEMERALD verwendet wird. Die zeitliche Überlappung zwischen Pump- und Stokes-Pulsen wird durch eine eingebaute Verzögerungsstufe erreicht und durch das SRS-Signal von reinem D2O am Mikroskop optimiert. |
| Inverses Laser-Scanning-Mikroskop | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Steuerbox | Olympus | Steuerung des Laser-Scanning-Mikroskops | |
| Kinematische Spiegelhalterung | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 flache Sechskant-Einsteller |
| L-Phenalynin | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Verstärker | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Dichromoischer Langpass-Strahlteiler | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm Laser BrightLine Einkantiger laserflacher dichroitischer Strahlteiler |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Objektträger | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Mikroskopie-Bildgebungssoftware | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[Fokus]=cmsInhalt11363 |
| NA Ölkondensator | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nagellack | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periskop-Baugruppe | Thorlabs | RS99 | Enthält die obere und untere Einheit sowie Oslash; 1" Pfosten und Klemmgabel. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | |
| geschirmte Box mit BNC-Anschlüssen | Pomona Electronics | 2902 | Aluminiumgehäuse mit Abdeckung, BNC-Buchse / Buchse |
| Si-Photodiodendetektor | Hausgemachte | N/A | DYI-Serie |
| Silizium-Wafer-Abstandshalter | |||
| Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ | |
| Spontane Raman-Spektroskopie | Horiba XploRA | N/A | |
| Stimulierte Raman-Streumikroskopie | Hausgemachte | N/A | |
| Berührung Panel Controller | Olympus | Steuerung der X-Y-Richtung des Laser-Scanning-Mikroskops | |
| Trypan Blue 0,4 % (0,85 % NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Pinzette | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Zwei-Photonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie | Hausgemachtes | N/ | |
| VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper | |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Steuert den Zurich Lock-in-Verstärker |
Referenzen
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
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