Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all’interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.
Abstract
La stampa 3D incorporata di cellule all’interno di un mezzo di supporto granulare è emersa nell’ultimo decennio come un potente approccio per la biofabbricazione a forma libera di costrutti di tessuti molli. Tuttavia, le formulazioni granulari in gel sono state limitate a un numero limitato di biomateriali che consentono la generazione economica di grandi quantità di microparticelle di idrogel. Pertanto, i supporti di supporto in gel granulare sono generalmente privi delle funzioni adesive e istruttive delle cellule presenti nella matrice extracellulare nativa (ECM).
Per affrontare questo problema, è stata sviluppata una metodologia per la generazione di compositi riutilizzabili autoriparanti a matrice particelle-extracellulare (SHAPE). I compositi SHAPE sono costituiti da una fase granulare (microgel) e da una fase continua (soluzione ECM viscosa) che, insieme, consentono sia la stampa programmabile ad alta fedeltà che un ambiente extracellulare biofunzionale regolabile. Questo lavoro descrive come la metodologia sviluppata può essere utilizzata per la biofabbricazione precisa di costrutti neurali umani.
In primo luogo, le microparticelle di alginato, che fungono da componente granulare nei compositi SHAPE, sono fabbricate e combinate con un componente continuo a base di collagene. Quindi, le cellule staminali neurali umane vengono stampate all’interno del materiale di supporto, seguite dalla ricottura del supporto. I costrutti stampati possono essere mantenuti per settimane per consentire la differenziazione delle cellule stampate in neuroni. Allo stesso tempo, la fase continua del collagene consente la crescita assonale e l’interconnessione delle regioni. Infine, questo lavoro fornisce informazioni su come eseguire l’imaging a fluorescenza delle cellule vive e l’immunocitochimica per caratterizzare i costrutti neurali umani stampati in 3D.
Introduction
La stampa 3D precisa e programmabile di costrutti di idrogel carichi di cellule che imitano i tessuti molli in vitro rappresenta una grande sfida. Ad esempio, i tentativi basati sull’estrusione diretta di idrogel morbidi sono intrinsecamente problematici, poiché le scarse proprietà meccaniche richieste per ricapitolare il microambiente in vivo portano a una mancanza di integrità strutturale, deformazioni delle caratteristiche predefinite o al completo collasso delle strutture fabbricate. Una soluzione convenzionale per questo problema consiste nel stampare un’impalcatura di supporto da un materiale biocompatibile più rigido che consenta al costrutto finale di mantenere la sua forma. Tuttavia, questo approccio limita notevolmente le possibilità di progettazione e richiede un’attenta messa a punto reologica degli inchiostri adiacenti.
Per superare i limiti della tradizionale stampa 3D basata sull’estrusione strato per strato, la stampa 3D incorporata è emersa negli ultimi anni come una potente alternativa alla fabbricazione di materiali morbidi e tessuti 1,2,3,4,5,6. Invece di estrudere l’inchiostro nell’aria ambiente sopra una superficie, l’inchiostro viene depositato direttamente attraverso un ago da siringa all’interno di un bagno di supporto che è solido a riposo ma fluidifica reversibilmente attorno alla punta dell’ago in movimento per consentire la deposizione precisa di materiale morbido carico di cellule. Il materiale depositato viene mantenuto in posizione mentre il supporto si risolidifica nella scia dell’ago. Pertanto, la stampa 3D integrata consente la fabbricazione a forma libera ad alta risoluzione di strutture complesse da biomateriali morbidi con possibilità di progettazione ampliate 7,8.
I gel granulari sono stati ampiamente esplorati come materiali da bagno di supporto per la stampa 3D incorporata, poiché possono essere formulati per esibire transizioni solido-liquido lisce, localizzate e reversibili a basse sollecitazioni di snervamento 9,10,11. Mentre mostrano eccellenti proprietà reologiche per la stampa ad alta risoluzione, i gel granulari sono stati limitati a una manciata di biomateriali12. La mancanza di diversità nelle formulazioni di gel granulari, che è particolarmente evidente se si considera l’ampia gamma di biomateriali disponibili per le formulazioni di idrogel sfuso, è causata dalla necessità di generare un gran numero di microgel utilizzando semplici sostanze chimiche. A causa del limitato panorama di biomateriali di supporti in gel granulare, la messa a punto del microambiente extracellulare fornito dal supporto di stampa rappresenta una sfida sul campo.
Recentemente, è stato sviluppato un approccio modulare per la generazione di supporti di stampa 3D incorporati, definiti compositi ricottura autoriparanti a matrice extracellulare (SHAPE)13. Questo approccio combina le distinte proprietà reologiche dei gel granulari con la versatilità biofunzionale delle formulazioni di idrogel sfuso. Il supporto composito SHAPE presentato è costituito da microparticelle di alginato impacchettate (fase granulare, frazione di volume ~ 70%) con uno spazio interstiziale aumentato riempito con una soluzione di pregel ECM a base di collagene viscoso (fase continua, frazione di volume ~ 30%). È stato inoltre dimostrato che il supporto SHAPE facilita la deposizione ad alta risoluzione di cellule staminali neurali umane (hNSCs) che, dopo la ricottura del bagno di supporto, possono essere differenziate in neuroni e mantenute per settimane per raggiungere la maturazione funzionale. La stampa 3D integrata all’interno del bagno di supporto SHAPE supera alcune delle principali limitazioni legate alle tecniche convenzionali per la biofabbricazione del tessuto neurale, fornendo al contempo una piattaforma versatile.
Questo lavoro descrive in dettaglio i passaggi per la stampa 3D incorporata di hNSC all’interno del supporto SHAPE e la loro successiva differenziazione in neuroni funzionali (Figura 1). In primo luogo, le microparticelle di alginato vengono generate attraverso la tosatura durante la gelificazione interna. Questo approccio consente la facile generazione di grandi volumi di microparticelle senza la necessità di attrezzature specializzate e reagenti citotossici. Inoltre, l’alginato è una fonte di materiale ampiamente disponibile ed economica per la formazione di substrati idrogel biocompatibili per una vasta gamma di tipi di cellule. Le microparticelle di alginato generate sono combinate con una soluzione di collagene per formare il materiale di supporto composito SHAPE. Quindi, gli hNSC vengono raccolti e caricati in una siringa come bioink cellulare per la stampa 3D. Una bioprinter 3D viene utilizzata per la stampa embedded basata sull’estrusione di hNSC all’interno del composito SHAPE. Le cellule stampate in 3D sono differenziate in neuroni per dare origine a costrutti neurali umani spazialmente definiti e funzionali. Infine, il protocollo descrive come i costrutti tissutali generati possono essere caratterizzati utilizzando l’imaging delle cellule vive e l’immunocitochimica. Inoltre, vengono forniti suggerimenti per l’ottimizzazione e la risoluzione dei problemi. In particolare, entrambi i componenti della fase granulare e continua potrebbero essere scambiati con altre formulazioni di idrogel per adattarsi a diverse porzioni biofunzionali, proprietà meccaniche e meccanismi di reticolazione, come richiesto da altri tipi di cellule e tessuti oltre le applicazioni neurali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approccio ai materiali compositi SHAPE fornisce un percorso versatile per la formulazione di bagni di supporto ricottura e biofunzionali per la stampa 3D incorporata di inchiostri cellulari. Mentre questo protocollo fornisce un esempio della stampa 3D di costrutti neurali, la cassetta degli attrezzi SHAPE potrebbe essere facilmente adattata alla biofabbricazione con altre fonti cellulari per l’ingegneria precisa di una gamma di tipi di tessuto target. L’approccio di stampa consentirebbe anche il pattern preciso di più…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è stata finanziata principalmente dal programma Horizon 2020 dell’Unione europea BrainMatTrain (n. H2020-MSCA-ITN-2015) nell’ambito della rete di formazione iniziale Marie Skłodowska-Curie e dell’accordo di sovvenzione n. 676408. C.R. e J.U.L. ringraziano la Fondazione Lundbeck (R250-2017-1425) e l’Independent Research Fund Denmark (8048-00050) per il loro sostegno. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento per il progetto HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
Referenzen
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