Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.
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Methodenartikel
Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die dreidimensionale (3D) Verkapselung von Sphäroiden ist entscheidend, um die Tumormikroumgebung für ein optimales Zellwachstum angemessen zu replizieren. Hier haben wir ein In-vitro-3D-Glioblastommodell für die Sphäroidverkapselung entwickelt, um die extrazelluläre Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen. Zuerst bildeten wir quadratische pyramidale Mikrotiterformen mit Polydimethylsiloxan. Diese Mikrotiterformen wurden dann zur Herstellung von Tumorsphäroiden mit streng kontrollierten Größen von 50-500 μm verwendet. Sobald sich Sphäroide gebildet hatten, wurden sie geerntet und in Hydrogele auf Polyethylenglykol (PEG)-Basis eingekapselt. PEG-Hydrogele sind eine vielseitige Plattform für die Sphäroidverkapselung, da Hydrogeleigenschaften wie Steifigkeit, Abbaubarkeit und Zelladhäsion unabhängig voneinander eingestellt werden können. Hier verwendeten wir ein repräsentatives weiches (~8 kPa) Hydrogel, um Glioblastom-Sphäroide einzukapseln. Schließlich wurde eine Methode zum Färben und Abbilden von Sphäroiden entwickelt, um mittels konfokaler Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Aufgrund des dichten Sphäroidkerns und der relativ spärlichen Peripherie kann die Bildgebung schwierig sein, aber die Verwendung einer Clearing-Lösung und konfokaler optischer Schnitte hilft, diese Bildgebungsschwierigkeiten zu lindern. Zusammenfassend zeigen wir eine Methode zur Herstellung einheitlicher Sphäroide, zur Verkapselung in PEG-Hydrogele und zur Durchführung einer konfokalen Mikroskopie an den verkapselten Sphäroiden, um das Sphäroidwachstum und verschiedene Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Einleitung
Tumorsphäroide haben sich als nützliche In-vitro-Werkzeuge bei der Untersuchung der Ätiologie, Pathologie und des Ansprechens auf Medikamente bei Krebserwiesen 1. Traditionell wurden Sphäroide unter Bedingungen wie Platten mit geringer Adhäsion oder Bioreaktoren kultiviert, bei denen die Zell-Zell-Adhäsion gegenüber der Zell-Oberflächen-Adhäsion bevorzugt wird2. Es ist jedoch inzwischen anerkannt, dass In-vitro-Sphäroidmodelle sowohl Zell-Zell- als auch Zell-Matrix-Interaktionen erfassen sollten, um die Tumormikroumgebung originalgetreuer zu rekapitulieren. Dies hat mehrere Gruppen dazu veranlasst, Ger....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Lösungen
- Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorläuferlösung
- Bereiten Sie die negative PDMS-Vorläuferlösung vor (wird auch für die Leimvorläuferlösung verwendet). Schöpfen Sie das Elastomer mit einem Spatel in ein Wägeschiffchen und wiegen Sie es. Geben Sie das Härter im Verhältnis 1:10 auf die Elastomerbasis. Mischen Sie PDMS und Härter vorsichtig und gründlich mit dem Spatel in der Kunststoffwaage.
HINWEIS: Diese PDMS-Vorläuferlösung wird in die quadratische pyramidale 6-Well-Mikrotiterplatte gegossen, um die Negativform zu bilden. Dies ist die gleiche Lösung, die für die Leimvorläuferlösung verwendet w....
- Bereiten Sie die negative PDMS-Vorläuferlösung vor (wird auch für die Leimvorläuferlösung verwendet). Schöpfen Sie das Elastomer mit einem Spatel in ein Wägeschiffchen und wiegen Sie es. Geben Sie das Härter im Verhältnis 1:10 auf die Elastomerbasis. Mischen Sie PDMS und Härter vorsichtig und gründlich mit dem Spatel in der Kunststoffwaage.
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Ergebnisse
Sphäroidbasierte Wirkstoff-Screening-Plattformen zur Untersuchung chemotherapeutischer Wirkungen werden zunehmend nachgefragt, da der Schwerpunkt auf der Modulation der Tumormikroumgebung bei der Sphäroidverkapselung in Biomaterialien liegt, die natives Gewebe replizieren. Hier haben wir eine Methode zur multizellulären Tumorsphäroidpräparation und anschließenden Verkapselung und Bildgebung in einem 3D-Hydrogel entwickelt. Die Sphäroide werden in Mikrotiterformen hergestellt (Abbildung 3A, <.......
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Diskussion
Hydrogel-basierte multizelluläre Tumor-Sphäroidmodelle werden zunehmend entwickelt, um die Entdeckungen der Krebstherapie voranzutreiben 11,13,29. Sie sind vorteilhaft, weil sie Schlüsselparameter der Tumormikroumgebung auf kontrollierte Weise emulieren und trotz ihrer Komplexität einfacher und kostengünstiger zu verwenden sind als In-vivo-Modelle, und viele sind mit Hochdurchsatz-Screening-Technologien kompatibel. Die Hydrogel-.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Startkapital finanziert, das Dr. Silviya P. Zustiak von der Saint Louis University zur Verfügung gestellt wurde, sowie durch ein Anschubstipendium des Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience an der Saint Louis University, das Dr. Silviya P. Zustiak gewährt wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| 24-Well-Platte Ultra Low Attachment Platten | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35 mm Petrischale | Amazon | 706011 | |
| 4-armiges Poly(ethylenglykol)-acrylat (4-armiges PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | ||
| 6-fach AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Kanada | 34421 | Quadratische pyramidenförmige Mikrovertiefungen |
| Spüllösung gegen Adhärenz | StemCell Technologies, Vancouver, Kanada | Katze #: 07010 | |
| Asparaginsäure-Arginin-Cystein-Glycin-Valin-Prolin-Methionin-Serin-Methionin-Arginin-Glycin-Cystein-Arginin-Asparaginsäure (DRCG-VPMSMR-GCRD) Peptid | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Kundenspezifische |
| Synthese Chemischer Abzug | KEWAUNEE | 99151 | |
| Corning Matrigel Basalmembran-Matrix, LDEV frei | Corning | 356234 | Basalmembran-Matrix-Waschmittel |
| - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Nichtionisches Tensid |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Einwegpipetten (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml(FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Fötales Rinderserum | HyClone | SH30073-03 | |
| Formaldehyd 37% Lösung | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Glasplatten | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Glastransferpipetten | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Glycin-Arginin-Cystein-Asparaginsäure-Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (GRCD-RGDS) Peptid | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Kundenspezifische Synthese |
| Hämazytometer | Bright-Line | 383684 | |
| Hydrophobe Lösung - Silan abstoßen | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| Inkubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Inverses Mikroskop (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanin-Perchlorat) | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Licht- und Leuchtstoffmikroskop (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| Mikroskop Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnologie | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7,4 | HyClone | SH30256,01 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Pipettenspitzen (1– 200 & Mikro; L, 101– 1000 &Mikro; L) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Standard-Einweg-Transferpipetten | aus Kunststoff Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Kunststoff-Wägeschiffchen (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| Poly(ethylenglykol)-dithiol (PEG-diSH; 3,4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polydimehylsiloxan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydimethylsiloxan |
| puderfreie Untersuchungshandschuhe | Quest | 92897 | |
| Propidiumiodid, 1 mg/mL wässriger Soln. | Fisher Wissenschaftlich | ||
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Silikon Abstandhalter - Silikonfolie, 0.5 mm dick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| Gewebekulturhaube | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Triethanolamin, ≥ 99,0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG humane Glioblastomzellen | American Type Culture Collection | HTB-14 |
Referenzen
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
