In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.
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Methodenartikel
Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.
Einleitung
Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten1. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessenwerden 2,3. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werde....
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Protokoll
Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung der Aufnahmekammer
- Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe besteht aus zwei Metallpfosten, die an einer kreisförmigen Platte befestigt sind. Die runde Platte enthält Nuten, die auf der Grundplatte arretiert werd....
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Ergebnisse
Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: der Kopfstützenchirurgie und der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung neuronaler Aktivitäten im Vorderhirn. Der Erfolg einer Operation wird durch das Überleben des Tieres und die Stabilität der Kopfstütze bestimmt. Die Überlebensrate kann durch häufige Perfusion von 0,01%iger TMS-Lösung durch den Mund während der Operation stark verbessert werden. Die Fische sollten sich von der Narkose erholen und innerhalb von 1-2 Minuten aktiv atmen, nachdem sie in das Wasser des Aquariums eingetauch.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden. Zweitens .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, und dem National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt. Die Maschinenwerkstatt des Instituts für Physik der Academia Sinica half bei der Herstellung von kundenspezifischen Teilen. Wir danken auch P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) für die Konstruktion des Schnellverschlussmechanismus der Kopfstufe.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Erwerbskarte | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Mikroskop |
| Rückprojektionsfilm | Kimoto | Diland-Bildschirm – GSK | Gegenwärtiger visueller Reiz |
| Bandpassfilter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Mikroskop |
| Grundplatte für den halbsechseckigen Tank | Maßgefertigt | Siehe Zusatzdateien | Aufnahmekammer |
| Kamerafilter (< 875 nm) | Edmund-Optik | #86-106 | Verhaltensaufzeichnung |
| Kamerafilter (>700 nm) | Edmund-Optik | #43-949 | Verhaltensaufzeichnung |
| Kameraobjektiv | Thorlabs | MVL50M23 | Verhaltensaufzeichnung |
| Chamäleon-Vision-S | Kohärent | Vision-S | Laser |
| Runde Platte für die Kopfbühne | Maßgefertigt | Siehe Zusatzdateien | Aufnahmekammer |
| Regler für Piezo-Aktuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Mikroskop |
| Stromverstärker | Thorlabs | TIA60 | Mikroskop |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | F-6 | Operation: UV-Lampe |
| Emissionsfilter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Mikroskop |
| Kopfstange | Maßgefertigt | Siehe Zusatzdateien | Aufnahmekammer |
| Infrarotlicht | Thorlabs | M810L3 | Verhaltensaufzeichnung |
| LED-Projektor | AAXA | P2B LED-Pico-Projektor | Gegenwärtiger visueller Reiz |
| Feuchtes Papierpapier (Kimwipe) | Kimtech-Wissenschaft | 34155 | Operation: feuchtes Papiertaschentuch |
| Motorisierte XY-Abtaststufe | Zaber | X-LRM050 | Mikroskop |
| Neutraldichtefilter (50 % Transmission) | Thorlabs | NE203B | Gegenwärtiger visueller Reiz |
| Ø 1/2" Pfostenhalter | ThorLabs | PH1.5V | Operation: hohles Rohr für Kanone |
| Ø 1/2" Edelstahl-Optikstift | ThorLabs | TR150/M | Chirurgie: Fisch-Lademodul |
| Objektiv 16x, 0,8NA | Nikon | CF175 | Mikroskop |
| Ölbasierte Modellierungston | Ly Hsin Clay | C4086 | Operation: Kopfstangenhalter |
| Optischer Klebstoff | Norland-Produkte | NOA68 | Operation: UV-aushärtbarer Kleber |
| Photomultiplierröhre | Hamamatsu | H11706P-40 | Mikroskop |
| Piezo-Aktuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Mikroskop |
| Pockels-Zelle | Konoptik | M350-80-LA-BK-02 | Mikroskop |
| Roter Wratten-Filter (> 600 nm) | Edmund-Optik | #53-699 | Gegenwärtiger visueller Reiz |
| Resonant-Galvo-Scansystem | INSS | RGE-02 | Mikroskop |
| Right-Angle Clamp für Ø 1/2" Pfosten | ThorLabs | RA90/M | Chirurgie: Fisch-Lademodul |
| Rotierende Klemme für Ø 1/2" Pfosten | ThorLabs | SWC/M | Chirurgie: Fisch-Lademodul |
| ScanImage | MBF Bioscience | Grundversion | Mikroskop |
| Halbsechseckiger Tank | Maßgefertigt | Siehe Zusatzdateien | Aufnahmekammer |
| Super-Bond C& B-Trikot | Sun Medical Co. | Super-Bond C& B | Operation: Zahnklement |
| Trikain-Methanesulfonat | Sigma Aldrich | E10521 | Operation: Anästhesie |
| USB-Kamera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Verhaltensaufzeichnung |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Operation: Gewebekleber |
Referenzen
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
