In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.
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Methodenartikel
Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist ein Fettgewebsdepot, das Blutgefäße umgibt und die Phänotypen weißer, beigefarbener und brauner Adipozyten aufweist. Neuere Entdeckungen haben die zentrale Rolle von PVAT bei der Regulierung der vaskulären Homöostase und der Beteiligung an der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beleuchtet. Ein umfassendes Verständnis der Eigenschaften und Regulation von PVAT ist von großer Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Therapien. Primärkulturen von periaortalen Adipozyten sind wertvoll für die Untersuchung der PVAT-Funktion und der Interaktion zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen. In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und praktikables Protokoll für die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus vorgestellt, das für die Modellierung der Adipogenese oder Lipogenese in vitro nützlich sein kann. Das Protokoll beschreibt die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten aus jungen Mäusen. Dieses Protokoll wird den technologischen Grundstein für die Untersuchung der PVAT-Funktion auf der Laborseite bilden.
Einleitung
Es wird angenommen, dass perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), eine perivaskuläre Struktur, die aus einer Mischung aus reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) besteht, über sein Sekretom parakrin mit der angrenzenden Gefäßwand interagiert1. Als kritischer Regulator der vaskulären Homöostase ist die PVAT-Dysfunktion an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt 2,3,4. Die SVF des Adipozytengewebes besteht aus mehreren erwarteten Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, Immunzellen, Mesothelzellen, neuronale Zellen sowi....
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Protokoll
Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Chest Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist (Zulassungsnummer: KS23010) und entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen sind für dieses Experiment zu bevorzugen.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Puffern und Nährmedien
- Chirurgische Instrumente (z. B. chirurgische Scheren und Standardpinzetten) bei 121 °C für 30 Minuten autoklavieren. Mikrochirurgische Instrumente mit 75%igem Alkohol desinfi....
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Ergebnisse
Mit diesem oben beschriebenen Protokoll haben wir sorgfältig PVATs isoliert, die die thorakalen Aorten der Maus umgeben (Abbildung 1A-D). Nach dem Waschen und Zerkleinern der PVATs in kleine Stücke mit einer sterilen Schere (Abbildung 1E,F) wurden die Gewebefragmente in einer Aufschlusslösung, die Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) enthielt, aufgeschlossen und bei 37 °C auf einem Schüttler für 30-45 Minuten inkubiert (
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Diskussion
Wir schlagen einen praktischen und praktikablen Ansatz für die Isolierung und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe der Maus vor. Die Vorteile dieses Protokolls sind, dass es einfach und kostengünstig ist. Eine ausreichende Anzahl von Mäusen ist entscheidend für eine erfolgreiche Isolierung, da unzureichendes Gewebe zu einer niedrigen SVF-Dichte und einem schlechten Wachstumszustand führen kann, was letztendlich die lipogene Effizienz beeinträchtigt. Darüber hinaus ist das Alt.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch anderer Art, zu deklarieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82130012 und 81830010) und den Nurture-Projekten für Grundlagenforschung des Shanghai Chest Hospital unterstützt (Fördernummer: 2022YNJCQ03).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Spritzenvorsatzfilter | PALL | 4612 | |
| 12-Well-Platte | Labselect | 11210 | |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-Trijod-L-thyronin (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Labselect | CT-002-50A | |
| Anti-Adiponektin | Abcam | ab22554 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| Anti-PPAR & Gamma; | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1.000 Arbeitskonzentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 Mäuse im Alter von 4-8 Wochen beiderlei Geschlechts | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Zellsieb 70 µ m, Nylon | Falcon | 352350 | |
| Kollagen aus Kalbsleder | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Kollagenase, Typ 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/ml |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/ml |
| fötales Rinderserum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| hohem Glukosegehalt | SH30022.01 | ||
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0,5 mM |
| Inkubator mit Orbitalschüttler | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (Rinder) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| Isofluran | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Lösung | Preislla | PB180347 | Schutz vor Licht |
| Mikrochirurgische Zange | Beyotime | FS233 | |
| Mikrochirurgische Schere | Beyotime | FS217 | |
| Öl Rot O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5.000 Arbeitskonzentration |
| Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | Arbeitskonzentration 1:5.000 |
| Rosiglitazon | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μ M |
| Standard-Pinzette | Beyotime | FS225 | |
| Chirurgische Schere | Beyotime | FS001 |
Referenzen
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
