Zellfreie DNA-Extraktion von Glaskörper- und Kammerwasserproben zur Diagnose und Überwachung des vitreoretinalen Lymphoms

Summary

Hier wird ein Verfahren zur Extraktion zellfreier DNA aus Glaskörper und Kammerwasser etabliert, um molekulare Studien zur Diagnose des vitreoretinalen Lymphoms durchzuführen. Die Methode bietet die Möglichkeit, gleichzeitig DNA aus der zellulären Komponente der Probe zu extrahieren oder für zusätzliche Tests zu reservieren.

Abstract

Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives Lymphom, das oft als primäres diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom des Zentralnervensystems kategorisiert wird. Um VRL zu diagnostizieren, werden Proben wie Glaskörper und neuerdings auch Kammerwasser gesammelt. Diagnostische Tests auf VRL an diesen Proben umfassen Zytologie, Durchflusszytometrie und molekulare Tests. Sowohl die Zytopathologie als auch die Durchflusszytometrie sowie molekulare Tests mit zellulärer DNA erfordern jedoch intakte ganze Zellen. Die Herausforderung liegt in der Tatsache, dass Glaskörper und Kammerwasser typischerweise eine geringe Zellularität aufweisen und viele Zellen während der Sammlung, Lagerung und Verarbeitung zerstört werden. Darüber hinaus stellen diese Proben aufgrund der hohen Viskosität des Glaskörpers und des geringen Volumens sowohl des Glaskörpers als auch des Kammerwassers zusätzliche Schwierigkeiten für die molekulare Untersuchung dar. In dieser Studie wird eine Methode zur Extraktion zellfreier DNA aus glasartigen und wässrigen Proben vorgeschlagen. Dieser Ansatz ergänzt die Extraktion zellulärer DNA oder ermöglicht es, die zelluläre Komponente dieser Proben für andere diagnostische Methoden, einschließlich Zytologie und Durchflusszytometrie, zu nutzen.

Introduction

Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives Lymphom, das mit einem diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom des primären Zentralnervensystems assoziiert^ist 1,2,3. VRL verläuft aufgrund ihrer Beteiligung am zentralen Nervensystem in der Regel tödlich ^1,2. Obwohl selten^1,4, zeigt sich VRL häufig mit Symptomen, die der posterioren Uveitis und anderen vitreoretinalen Erkrankungen ähneln ^4,5. Folglich benötigen Patienten mit Uveitis-Symptomen eine Diagnose, um eine VRL entweder zu bestätigen oder auszuschließen.

Kürzlich wurden Konsenskriterien für die Diagnose von VRL veröffentlicht, die eine Kombination aus klinischer Untersuchung und Laborbefunden beinhalten⁶. Zu den Proben, die häufig zur Diagnose von VRL verwendet werden, gehören Glaskörper und in jüngerer Zeit Kammerwasser⁷. Der Glaskörper wird durch ein chirurgisches Verfahren namens Pars-plana-Vitrektomie gewonnen, das den Zugang zum hinteren Augenabschnitt ermöglicht⁸.

In dem vorgestellten Protokoll wurden sowohl Kammerwasser- als auch Glaskörperproben für die zelluläre und cfDNA-Extraktion gesammelt. Nach der Anästhesie der Patienten und der Platzierung von Trokaren ca. 4 mm vom Hornhautlimbus entfernt wurde eine Kammerwasserprobe von ca. 100-200 μl mit einer 1-ml-Tuberkulinspritze am Hornhautlimbus entnommen. Bei pseudophaken Patienten wurde unverdünnter Glaskörper durch Zuführen steriler Luft in die Infusion erhalten, wodurch eine größere Menge unverdünnten Glaskörpers (bis zu 3,5 ml) entnommen werden konnte. Bei phaken Patienten wurden etwa 500 bis 1000 μl unverdünnter Glaskörper entfernt, bevor eine Infusion mit ausgewogener Salzlösung eingeschaltet wurde. In einigen Fällen wurde sekundär verdünnter Glaskörper (500 bis 2.000 μl) gesammelt, indem die Infusion auf Flüssigkeit umgestellt und der Vitrektor in den Glaskörperrand gelegt wurde, um diese Probe zu erhalten. Die am stärksten verdünnte Glaskörperfraktion wurde gesammelt, indem der Kassettenbeutel (ergänzende Abbildung 1) am Ende der Operation aufbewahrt wurde. Sobald dieser Beutel die Pathologieabteilung erreichte, wurde verdünnter Glaskörper gewonnen, indem Flüssigkeit aus diesem Beutel in konische Röhrchen für die anschließende DNA-Extraktion abgelassen wurde.

Die Zytopathologie der Glaskörperflüssigkeit wird oft als Goldstandard angesehen⁹. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Sensitivität aufgrund der Verarbeitung und der minimalen Zellularität begrenzt ist^10,11,12. Die Durchflusszytometrie kann bei der Identifizierung klonaler B-Zellen helfen, kann aber auch durch eine geringe Zellularität und die Fragilität großer Lymphomzellen eingeschränkt sein^13,14,15. Sowohl für die Zytopathologie als auch für die Durchflusszytometrie werden intakte ganze Zellen benötigt. Viele dieser Zellen werden bei der Sammlung, Lagerung und Verarbeitung zerstört. Wenn molekulare Tests mit DNA durchgeführt werden, die aus intakten Zellen extrahiert wurde (zelluläre DNA), leiden sie unter derselben Einschränkung. Darüber hinaus reduziert die Teilung der begrenzten Glasprobe für alle diese Tests die Menge an Material, die für jeden Test zur Verfügung steht.

Zellfreie DNA (cfDNA) stellt eine weitere DNA-Quelle dar, die keine intakten Zellen benötigt. cfDNA aus Glaskörperproben wurde für den Nachweis von VRL ^16,17 sowie Aderhautmelanom¹⁸ verwendet. In diesem Protokoll wird zelluläre und zellfreie DNA aus Glaskörper und wässriger Flüssigkeit extrahiert, um VRL nachzuweisen.

Protocol

Das vorliegende Protokoll folgt den Richtlinien für die menschliche Pflege und wurde vom Institutional Review Board (IRB) der University of Michigan genehmigt. Hierfür wurde vom IRB eine Befreiung von der Einwilligungserklärung eingeholt. Es gibt keine relevanten Ein- oder Ausschlusskriterien für die betroffenen Patienten.

1. Trennung von zellulären und zellfreien Bestandteilen

HINWEIS: Für die VRL-Diagnostik können drei Arten von Proben entnommen werden: Glaskörper (unverdünnt; Flüssigkeit aus der Vitrektomie, die vor Beginn der Infusion entnommen wird), verdünnter Glaskörper in einem Kassettenbeutel (Abbildung 1) und Kammerwasser (Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer).

1. Bei unverdünnter Glaskörperflüssigkeit, die sehr viskos ist, mit 3-5 ml PBS verdünnen, um das Pipettieren zu erleichtern.
2. Bei verdünntem Glaskörper im Kassettenbeutel (ergänzende Abbildung 1) Flüssigkeit in konische 50-ml-Röhrchen (eines pro 45 ml Flüssigkeit) ablassen.
3. Das Kammerwasser hat ein sehr geringes Volumen (<200 μl). Um eine maximale Rückgewinnung der Zellen zu gewährleisten, überführen Sie die Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, spülen Sie das ursprüngliche 500-μl-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Probe gesammelt wurde, mit einem gleichen Volumen PBS und geben Sie es in das 1,5-ml-Röhrchen.
4. Glaskörper oder wässrige Flüssigkeit bei 3.000 x g 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören.

2. DNA-Extraktion aus der zellulären Komponente

1. Fügen Sie eine angemessene Menge der Zelllyselösung hinzu (300 μl für kleine Pellets, 1 ml oder mehr für größere Pellets) (siehe Materialtabelle). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
2. Nach vollständiger Lysierung wird 1/3 des Gesamtvolumens der Proteinpräzipitatlösung (100 μl für 300 μl Lysat) zugegeben (siehe Materialtabelle).
3. 20-30 s kräftig wirbeln. 3 min bei 3.000 x g bei Raumtemperatur schleudern.
4. 300 μl Isopropanol in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Pipettieren Sie den Überstand aus dem vorherigen Schritt vorsichtig in das Isopropanolröhrchen.
5. Fügen Sie 1,5 μl 20 mg/ml Glykogen (für 300 μl Lyse) hinzu (siehe Materialtabelle).
6. Mischen Sie gut durch Inversion und legen Sie die Probe dann für 1 h bis über Nacht in einen Gefrierschrank bei -20 °C, um die DNA-Ausfällung zu unterstützen.
7. Zentrifugieren Sie das 1,5-ml-Röhrchen 5 Minuten lang bei 3.000 x g bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie das Isopropanol ab.
8. Fügen Sie 0,5 ml 70%iges Ethanol hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um das Pellet zu waschen.
9. 1 min bei 3.000 x g bei Raumtemperatur schleudern und das Ethanol umfüllen. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche einmal.
10. Drehen Sie das Röhrchen auf saubere Gaze, um die Lösung abzutropfen und das Pellet oder die Karaffe zu trocknen. Schleudern Sie die DNA schnell in einer Mikrozentrifuge und pipettieren Sie den verbleibenden Tropfen Ethanol mit einer feinen Einwegpipettenspitze (sobald kein Restethanol mehr im Röhrchen ist, sollte die DNA in 5-10 Minuten trocken und bereit sein, zu hydratisieren).
11. Geben Sie 45 μl DNA-Hydratationslösung (siehe Materialtabelle) in das getrocknete DNA-Pellet.
12. Legen Sie das Röhrchen in einen Heizblock bei 50 °C und lassen Sie es 1-2 h lang auflösen. Pipetieren Sie die DNA nach oben und unten, um den Hydratationsprozess zu beschleunigen.
    HINWEIS: Fügen Sie mehr DNA-Hydratationslösung hinzu, wenn die Probe zu viskos erscheint.

3. Zellfreie DNA-Extraktion

1. Die Menge des Überstandes aus Schritt 1.5 ist variabel. Fügen Sie 70 μl Konditionierungspuffer (siehe Materialtabelle) für jeden Milliliter des Überstandes hinzu.
2. Mischen Sie die Reinigungsperlen gut, indem Sie sie vortexieren. Fügen Sie 10 μl Reinigungsperlen hinzu, wenn Sie <14 ml zellfreien Überstand, 20 μl bei der Verarbeitung von 14-40 ml verarbeiten.
3. Mischen Sie die Mischung aus Probe und Kügelchen gut, indem Sie sie vortexieren. Bei 3.000 x g 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
4. Ohne das Pellet zu stören, pipettieren Sie den Überstand heraus und lassen 100 μl zurück, wenn 10 μl Reinigungsperlen verwendet werden, und 200 μl, wenn 20 μl Reinigungsperlen verwendet werden.
5. Geben Sie ein gleiches Volumen Urinpellet-Aufschlusspuffer (siehe Materialtabelle) in das Pellet und resuspendieren Sie das Pellet durch Wirbeln oder Pipettieren.
6. Proteinase K (5% (v/v)) zum resuspendierten Pellet geben (z. B. 10 μl Proteinase K zu 200 μl Gemisch hinzufügen) und durch sanftes Vortexen gut mischen.
7. Die Pelletmischung bei 55 °C 30 min inkubieren.
8. Geben Sie ein Volumen genomischen Lysepuffer (siehe Materialtabelle) zu der Aufschlussmischung (z. B. 210 μl genomischer Lysepuffer auf 210 μl Aufschlussmischung) und mischen Sie durch Vortexing.
9. Die handelsübliche Schleudersäule (siehe Materialtabelle) in ein neues Sammelröhrchen überführen.
10. 200 μl Urin-DNA-Prep-Puffer in die Spin-Säule geben, bei ≥16.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
11. 700 μl Urin-DNA-Waschpuffer in die Säule geben, bei ≥16.000 x g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
12. Wiederholen Sie den Schritt mit 200 μl Urin-DNA-Waschpuffer.
13. Die Spin-Säule wird in ein DNase/RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
14. Geben Sie das entsprechende Volumen des DNA-Elutionspuffers (basierend auf den durchzuführenden molekularen Tests) direkt auf die Säulenmatrix und lassen Sie sie 3-5 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
    HINWEIS: In den Beispielfällen wurden 30 μl Elutionspuffer verwendet. Es wird mehr Elutionspuffer verwendet, wenn zusätzliche Tests erforderlich sind.
15. Bei ≥16.000 x g bei Raumtemperatur 1 min zentrifugieren, um die zellfreie DNA zu erhalten.

Results

Diese Extraktionsmethoden wurden an einer begrenzten Anzahl von Fällen durchgeführt, um eine ausreichende Ausbeute und Amplifizierbarkeit der zellfreien DNA im Vergleich zur zellulären DNA aus den glasigen (vier) und wässrigen (vier) Proben zu gewährleisten. Aus diesen Proben sind die DNA-Ausbeuten der zellfreien Komponente dieser Flüssigkeiten ähnlich wie die der zellulären Komponente (Tabelle 1). Zelluläre und cfDNA aus diesen Proben wurden ebenfalls mit molekularen Tests untersucht, z. B. auf die VRL-assoziierte Mutation MYD88 L265P. Eine allelspezifische real-time PCR für MYD88 L265P (Abbildung 1) veranschaulicht den Nachweis dieser VRL-assoziierten Mutation sowohl in zellulärer DNA als auch in cfDNA. In diesem Beispiel scheint die Krankheitslast in der zellfreien Komponente höher zu sein, was durch eine niedrigere (Zyklusschwelle (Ct) veranschaulicht wird. Diese Daten verdeutlichen, dass cfDNA, die mit dieser Methode aus Glaskörper und Kammerwasser extrahiert wird, eine DNA-Quelle ergibt, die auch für diagnostische molekulare Tests verwendet werden kann.

Abbildung 1: MYD88 L265P Allel-spezifische Real-Time-PCR. Repräsentatives Amplifikationsdiagramm mit MYD88 L265P-Allel-spezifischer Real-Time-PCR für zelluläre und zellfreie DNA (jede PCR-Reaktion wird in zweifacher Ausführung durchgeführt). Der Schwellenwert für den Zyklusschwellenwert (Ct) wird durch die grüne Linie angezeigt. Die Punkte, an denen die Amplifikation von cfDNA (blaue und braune Spuren) und zellulärer DNA (rote und grüne Spuren) - jeweils in doppelter Ausführung - den Schwellenwert erreicht, werden markiert. Die Hintergrundfluoreszenz liegt in der Nähe von 1,00e-003 vor. Eine höhere Mutationslast liegt in der zellfreien Komponente vor, was sich in einem niedrigeren CT zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	Handy	Frei von Zellen
Glaskörper 1	130.5	67.5
Glaskörper 2	337.5	105
Glaskörper 3	150	168
Glaskörper 4	1816	654
Wässrig 1	58.5	40.5
Wässrig 2	153	225
Wässrig 3	117	454.5
Wässrig 4	TL	27

Tabelle 1: Zelluläre und zellfreie DNA-Extraktionserträge. DNA-Ausbeute (in ng) für vier unverdünnte Glaskörper- und vier Kammerkammerflüssigkeiten von vier verschiedenen Individuen basierend auf fluorometrischer DNA-Quantifizierung. TL = zu niedrig, um es zu quantifizieren.

Ergänzende Abbildung 1: Kassettenbeutel aus Glas. Beispiel für einen Glaskörperkassettenbeutel mit verdünnter Glaskörperflüssigkeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives großzelliges B-Zell-Lymphom ^1,2,3, dessen Symptome andere vitreoretinale Erkrankungen nachahmen können ^4,5. Die molekulare Untersuchung von Glaskörper und in jüngster Zeit auch von Kammerwasser ist zu einer entscheidenden Methode geworden, um die Diagnose einer VRL zu stellen oder auszuschließen. Diese Flüssigkeiten haben jedoch ein sehr geringes Volumen und weisen oft eine geringe Zellularität auf. Viele der Zellen in diesen Flüssigkeiten können auch während der Sammlung, Lagerung und Verarbeitung beschädigt werden^13,14,15. Infolgedessen sind die DNA-Ausbeuten aus diesen Proben oft gering. Darüber hinaus müssen die Zellen aus diesen Flüssigkeiten mit anderen diagnostischen Methoden, einschließlich Zytopathologie und Durchflusszytometrie, geteilt werden. Die zellfreie DNA (cfDNA) in diesen Flüssigkeiten stellt eine weitere DNA-Quelle dar, die keine intakten Zellen benötigt.

Dieses Protokoll trennt die zellulären und zellfreien Bestandteile von Glaskörper oder wässriger Flüssigkeit. Glaskörperflüssigkeit wird mit PBS verdünnt, um aufgrund ihrer Viskosität das Pipettieren zu ermöglichen. Wässrige Flüssigkeit wird gehandhabt, um eine maximale Rückgewinnung dieser Flüssigkeit mit sehr geringem Volumen zu gewährleisten.

Ein Vergleich der DNA-Ausbeuten dieser beiden Komponenten zeigt, dass aus der zellfreien Komponente erhebliche zusätzliche Nukleinsäure gewonnen werden kann. Molekulare Tests von cfDNA, wie z.B. die MYD88 L265P Allel-spezifische Real-Time-PCR, zeigen, dass VRL sowohl in der zellfreien Komponente des Glaskörpers und des Kammerwassers als auch in der zellulären Komponente nachgewiesen werden kann. In vielen Fällen ist die relative Menge an VRL in der zellfreien Komponente höher als in der zellulären (Abbildung 1).

Die Extraktion der zellfreien Komponente von glasiger und wässriger Flüssigkeit ermöglicht die molekulare Bewertung einer Komponente dieser Flüssigkeiten, die sonst verworfen würde. Da VRL in zellulären und zellfreien Komponenten vertreten ist, könnten zelluläre DNA und cfDNA kombiniert werden, um die verfügbare DNA aus diesen begrenzten Proben zu maximieren. Alternativ könnte die zellfreie Komponente dieser Flüssigkeiten für molekulare Tests verwendet werden, und die zelluläre Komponente könnte für Tests verwendet werden, die intakte Zellen erfordern, d. h. Zytopathologie und Durchflusszytometrie. Dieser Ansatz würde vermeiden, dass jedem Test separate Aliquots dieser Flüssigkeiten zugewiesen werden, was die Empfindlichkeit jedes Tests für den Nachweis von VRL beeinträchtigen kann. Angesichts des Erfolgs dieser Methode in glasigen und wässrigen Proben kann diese Methode auch in anderen begrenzten Flüssigkeiten nützlich sein, um die Menge an DNA, die für molekulare Tests zur Verfügung steht, zu erhöhen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Reinigen & Reinigen Konzentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Reinigen & Reinigen Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Zelllyselösung	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA-Hydratationslösung	Qiagen	158916
Gentra Puregene Proteinfällungslösung	Qiagen	158912
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urin-Kit	Zymo Research	D3061	Konditionierungspuffer; enthält auch Clearing-Kügelchen, Proteinase K und Spin-Säulen
Ultrareines Glykogen, 20 & Mikro; g/µ L (20 mg/ml)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010