Eencellige sortering van immunofenogetypeerde mesenchymale stamcellen van menselijke geëxfolieerde bladverliezende tanden
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering van menselijke mesenchymale stamcellen met behulp van de single-cell sorteermethode. In het bijzonder kan het gebruik van eencellige sortering een zuiverheid van 99% van de immunofenogetypeerde cellen uit een heterogene populatie bereiken in combinatie met een op multiparametrische flowcytometrie gebaseerde benadering.
Abstract
De mesenchymale stamcellen (MSC’s) van een organisme bezitten een buitengewoon vermogen om te differentiëren in meerdere afstammingslijnen van volwassen cellen in het lichaam en staan bekend om hun immunomodulerende en ontstekingsremmende eigenschappen. Het gebruik van deze stamcellen is een zegen voor het gebied van regeneratieve biologie, maar tegelijkertijd een vloek voor regeneratieve geneeskunde en therapieën vanwege de vele cellulaire dubbelzinnigheden die ermee gepaard gaan. Deze ambiguïteiten kunnen voortkomen uit de diversiteit in de bron van deze stamcellen en uit hun in vitro groeiomstandigheden, die beide een weerspiegeling zijn van hun functionele heterogeniteit.
Dit garandeert methodologieën om gezuiverde, homogene populaties van MSC’s te leveren voor therapeutische toepassingen. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie heeft de detectie van eencellige populaties mogelijk gemaakt met behulp van een multiparametrische benadering. Dit protocol schetst een manier om stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED’s) te identificeren en te zuiveren door middel van fluorescentie-ondersteunde eencellige sortering. Gelijktijdige expressie van oppervlaktemarkers, namelijk CD90-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), CD73-peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP-Cy5.5), CD105-allofycocyanine (APC) en CD44-V450, identificeerde de “heldere”, positieve uitdrukkers van MSC’s met behulp van multiparametrische flowcytometrie. Er werd echter een significante daling waargenomen in het percentage viervoudige uitdrukkers van deze positieve markers vanaf passage 7 tot de latere passages.
De immunofenogetypeerde subpopulaties werden gesorteerd met behulp van de eencellige sorteermodus, waarbij slechts twee positieve en één negatieve marker de inclusiecriteria vormden. Deze methodologie zorgde voor de levensvatbaarheid van de cellen van de gesorteerde populaties en handhaafde de celproliferatie na het sorteren. De stroomafwaartse toepassing voor een dergelijke sortering kan worden gebruikt om afstammingsspecifieke differentiatie voor de gated subpopulaties te evalueren. Deze aanpak kan worden toegepast op andere eencellige systemen om de isolatieomstandigheden te verbeteren en voor het verkrijgen van informatie over markers op het oppervlak van meerdere cellen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) kunnen worden beschouwd als een schaalbare bron van cellen die geschikt zijn voor celgebaseerde therapieën en kunnen worden beschouwd als een gouden standaardsysteem in de regeneratieve geneeskunde. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen in het lichaam met verschillende weefseloorsprongen1. Afhankelijk van het bronweefsel vertoont elk type MSC een dubbelzinnig in vitro gedrag2. Dit is goed te zien aan hun morfologische en functionele eigenschappen3. Meerdere studies hebben intraklonale variatie in dimensies aangetoond, waaronder differentiatie van volwassen weefsel, genomische toestand en metabole en cellulaire architectuur van MSC’s 2,4.
Immunofenotypering van cellen is een veel voorkomende toepassing van flowcytometrie voor de identificatie van stamcellen en dit werd in 2006 door de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) gebruikt om een lijst met minimale criteria voor te schrijven om cellen als MSC’s te identificeren. Het verklaarde dat samen met plastische adherence en het vermogen om in vitro te differentiëren in drie afstammingslijnen (osteogeen, chondrogenisch en adipogeen), ≥95% van de celpopulatie CD105, CD73, CD90 tot expressie moet brengen, en dat deze cellen de expressie (≤2% positief) van CD34, CD45, CD11b, CD14 en HLA-DR moeten missen, zoals gemeten met flowcytometrie5. Hoewel de MSC’s werden gedefinieerd door een reeks biomarkers volgens de minimale criteria van de ISCT, konden hun immuuneigenschappen niet worden gebenchmarkt met deze biomarkers en was er behoefte aan meer dan deze criteria om vergelijkingen tussen studies en klonale variaties gemakkelijker tekwantificeren 2.
Ondanks de richtlijnen van ISCT heeft uitgebreid onderzoek naar MSC’s aangetoond dat er heterogeniteit bestaat in deze populatie, die kan ontstaan als gevolg van een veelheid aan factoren, voornamelijk als gevolg van de alomtegenwoordige aard van heterogeniteit die ontstaat tussen MSC-donoren6, weefselbronnen7, individuele cellen binnen een klonale populatie8 en kweekomstandigheden2,9, 10. okt. Karakterisering en zuivering van deze primaire cellen uit verschillende weefselbronnen om de kwaliteit en het lot van de cellen te waarborgen, zijn belangrijke stappen in hun productie. De noodzaak om de getoonde variaties onder de populatie te begrijpen, vereist een efficiënte methode om deze op te lossen in subpopulaties die afzonderlijk kunnen worden onderverdeeld en verzameld11. Analyses op celniveau helpen de uitdagingen van celvariatie te overwinnen, biologische ruis te verminderen die voortkomt uit een heterogene populatie en bieden de mogelijkheid om zeldzame cellen te onderzoeken en te karakteriseren12.
Op basis van het doel en de gekozen parameters kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de geselecteerde populaties te sorteren en te verrijken. Celsorteertechnieken kunnen zowel bulksortering als single-cell sorteermethoden omvatten. Terwijl bulksortering doelpopulaties kan verrijken door middel van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)13, fractionering 14 en elutriatie15, kan eencellige sortering meer homogene populaties verrijken door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)11. Tabel 1 geeft een vergelijkende analyse van elk van deze methoden met zijn eigen voor- en nadelen.
Tabel 1: Vergelijkende analyses van verschillende technieken: MACS, fractionering, elutriatie en FACS, waarbij de verschillen in hun principe en de voor- en nadelen van het kiezen van een bepaalde techniek boven een andere worden benadrukt. Afkortingen: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Sinds de komst van de techniek heeft single-cell flowcytometrie een belangrijke rol gespeeld bij het opsommen16, de detectie en karakterisering van een specifieke celpopulatie in een heterogeen monster17. Hewitt et al. legden in 2006 de basis voor een geautomatiseerde celsorteermethode om de isolatie van homogene pools van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESC’s) te verbeteren18. Single-cell sortering verrijkte de populatie van GFP-getransduceerde hESC’s waardoor de isolatie van genetisch gemodificeerde klonen werd vergemakkelijkt, wat een nieuwe dimensie in klinisch onderzoek opende. Om de sorteerefficiëntie te verbeteren, zijn over het algemeen twee benaderingen gevolgd; Ofwel worden de verzamelmedia van de gesorteerde populaties aangepast om de levensvatbaarheid en proliferatie van nagesorteerde cellente behouden 19 , ofwel wordt het algoritme/de software voor het sorteren van cellen op passende wijze aangepast12.
Met de vooruitgang van de technologie zijn commerciële flowcytometers en celsorteerders in staat geweest om uitdagingen aan te pakken die werden aangegaan bij het aseptisch sorteren van fragiele en zeldzame celpopulaties, met name stamcellen van verschillende oorsprong. Een van de grootste uitdagingen van stamcelbiologen is de klonale isolatie van menselijke pluripotente stamcellen volgens transfectieprotocollen die vereist zijn in genbewerkingsstudies19. Dit werd aangepakt door afzonderlijke cellen te sorteren in platen met 96 putjes die werden gecoat met Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF’s), samen met supplementen en commerciële ROCK-remmers met kleine moleculen. Celisolatiestrategieën kunnen echter grotendeels worden verfijnd met behulp van indexsortering, een kenmerk van het sorteeralgoritme dat het immunofenotype van individuele gesorteerde cellen identificeert12. Deze verfijnde modaliteit bij het sorteren van eencellige cellen hielp niet alleen bij het verbeteren van de sorteerefficiëntie voor stamcellen, vooral met betrekking tot zeldzame hematopoëtische stamcelpopulaties, maar koppelde ook efficiënt eencellige klonen aan hun stroomafwaartse functionele assays20.
Dit artikel richt zich op het sorteren van eencellige cellen van immunofenogetypeerde stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED’s) voor de verrijking van subpopulaties om hun functionele differentiatiecapaciteiten te bestuderen. Met behulp van een combinatie van twee MSC-positieve markers, CD90 en CD73, en een negatieve hematopoëtische marker CD45, werden de MSC’s immunofenotypeerd en werden de dim- en null-expressoren geïdentificeerd. Op basis van hun immunofenotype werden de subpopulaties geïdentificeerd als zuivere MSC’s, enkelvoudige positieve en dubbelnegatieve populaties. Ze werden gesorteerd met behulp van de single-cell sorteringsmodus om zuivere en verrijkte subpopulaties te verkrijgen voor verdere functionele studies om vast te stellen of de differentiële expressie van markers een artefact was van in vitro kweekomstandigheden of dat het ook enig effect heeft op de functionele eigenschappen. Cellen die geen homogene expressie waren van de “positieve MSC-markers” werden gesorteerd om hun functionele eigenschappen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op het gebied van weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde, onder de postnatale bronnen, hebben MSC’s afkomstig van oraal weefsel grote belangstelling gewekt vanwege hun minimale ethische verplichtingen en opmerkelijk differentiatiepotentieel voor meerdere afstammingslijnen21. Tandpulpstamcellen (DPSC’s) van de getroffen derde kies en SHED’s hebben de meeste aandacht gekregen onder tandheelkundige MSC’s vanwege hun therapeutisch potentieel bij neurodegeneratieve en traumatische<sup class="x…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de Flow Cell Facility van het Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, India, voor het gebruik van de kernfaciliteit voor flowcytometrie. De cryo-sectie van de pelletcultuur van gedifferentieerde cellen werd uitgevoerd in het Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, India. Dit werk werd ondersteund door de intramurale financiering van UC van de Manipal Academy of Higher Education (MAHE), India. AG is dankbaar voor de steun van de Dr. T. M. A. Pai Scholarship van MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Referenzen
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- . . FACSAria Fusion User’s Guide. , (2018).
