Das Protokoll beschreibt eine effiziente und zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Poly(A)-Länge des interessierenden Gens aus dem Drosophila-Nervensystem , die leicht an Gewebe oder Zelltypen anderer Spezies angepasst werden kann.
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Methodenartikel
Messung der Poly-A-Schwanzlänge aus Drosophila-Larvengehirn und Zelllinien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Polyadenylierung ist eine entscheidende posttranskriptionelle Modifikation, bei der Poly(A)-Schwänze an das 3'-Ende von mRNA-Molekülen angehängt werden. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird durch zelluläre Prozesse streng reguliert. Eine Dysregulation der mRNA-Polyadenylierung wurde mit abnormaler Genexpression und verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs, neurologische Störungen und Entwicklungsstörungen. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Polyadenylierung von entscheidender Bedeutung, um die Komplexität der mRNA-Prozessierung und der posttranskriptionellen Genregulation zu entschlüsseln.
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Poly(A)-Schwanzlängen in RNA-Proben vorgestellt, die aus Drosophila-Larvengehirnen und Drosophila-Schneider-S2-Zellen isoliert wurden. Wir verwendeten den Guanosin/Inosin (G/I)-Tailing-Ansatz, bei dem G/I-Reste enzymatisch am 3'-Ende der mRNA unter Verwendung von Hefe-Poly(A)-Polymerase hinzugefügt werden. Diese Modifikation schützt das 3'-Ende der RNA vor enzymatischem Abbau. Die geschützten Poly(A)-Schwänze in voller Länge werden dann mit einem universellen Antisense-Primer rückwärts transkribiert. Anschließend wird die PCR-Amplifikation mit einem genspezifischen Oligo durchgeführt, das auf das interessierende Gen abzielt, zusammen mit einem universellen Sequenzoligo, das für die reverse Transkription verwendet wird.
Dadurch werden PCR-Produkte erzeugt, die die Poly(A)-Schwänze des interessierenden Gens umfassen. Da die Polyadenylierung keine einheitliche Modifikation ist und zu unterschiedlich langen Schwänzen führt, weisen die PCR-Produkte eine Reihe von Größen auf, was zu einem Abstrichmuster auf Agarosegel führt. Abschließend werden die PCR-Produkte einer hochauflösenden Kapillargelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Quantifizierung anhand der Größen der Poly(A)-PCR-Produkte und des genspezifischen PCR-Produkts. Diese Technik bietet ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug zur Analyse von Poly(A)-Schwanzlängen, das es uns ermöglicht, tiefere Einblicke in die komplizierten Mechanismen der mRNA-Regulation zu gewinnen.
Einleitung
Die meisten eukaryotischen mRNAs werden an ihrem 3′-Terminus im Zellkern durch Zugabe von nicht-template-Adenosinen durch kanonische Poly(A)-Polymerasen posttranskriptionell polyadenyliert. Ein intakter Poly(A)-Schwanz ist während des gesamten Lebenszyklus von mRNA von entscheidender Bedeutung, da er für den mRNA-Kernexportunerlässlich ist 1, die Interaktion mit Poly(A)-bindenden Proteinen erleichtert, um die Translationseffizienz zu verbessern2, und Resistenz gegen Abbauverleiht 3. In bestimmten Fällen kann der Poly(A)-Schwanz auch im Zytoplasma gedehnt werden, was durch nicht-kanonische Poly(A)-....
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Protokoll
1. Aufzucht und Selektion von Drosophila-Larven
- Den Fliegenstamm (w1118, Wildtyp) auf Standard-Fliegenfuttermedium bei 25 °C in einem befeuchteten Inkubator pflegen/kultivieren.
- Wählen Sie 10 wandernde Larven des 3. Stadiums 72 h nach der Eiablage aus.
- Legen Sie die Larven in eine leere 35-mm-Petrischale und waschen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Larven mit einer Pinzette in die neue Schale mit Leitungswasser geben. Tun Sie dies 2x, um restliche Lebensmittel zu entfernen.
2. Isolierung des Gehirns von
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Ergebnisse
Hier analysierten wir die Poly(A)-Schwanzlänge von Dscam1 und GAPDH aus Drosophila-Larvengehirnen (Abbildung 4). Isolierte RNAs wurden zur Qualitätskontrolle auf einem Agarosegel visualisiert. Eine einzelne RNA-Bande bei einer Nukleotidgröße von etwa 600 weist auf eine intakte RNA-Präparation hin (Abbildung 2A). Die RNAs wurden mit einem Agilent 2100 Bioanalysator dem G/I-Tailing und der hochauflösenden Kapillarelektrophorese unterzoge.......
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Diskussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik zur Sezierung des Drosophila-Larvengehirns aus dem wandernden 3. Stadium sowie die Probenvorbereitung aus Drosophila S2-Zellen. Aufgrund der labilen Natur von mRNAs erfordert die Probenentnahme besondere Vorsicht. Bei der Larvendissektion des Gehirns sollte das Gehirn während der Isolation nicht beschädigt und nicht über einen längeren Zeitraum in Lösung gehalten werden. Es ist wichtig, die Sezierzeit für eine Sezierrunde auf 8-10 Minuten zu hal.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 an J.K. und der Cellular and Molecular Imaging Core Facility an der University of Nevada, Reno, unterstützt, die von den National Institutes of Health Grant P20GM103650 unterstützt und für die in dieser Studie berichtete Forschung verwendet wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) | Research Product International (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent Software 2100 Expert kostenloser Download Demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethylpyrocarbonat (DEPC) | Research Product International (RPI) | D43060 | |
| DNA-Farbstoff (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2-Zelllinie | Drosophila Genomics Resource Center Bestand #181 | ||
| Drosophila Schneider' s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidiumbromid | Genesee wissenschaftlich | 20-276 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Pinzette Dumont 5 | Werkzeuge der Feinforschung | 11254-20 | |
| Nukleasefreies Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product International (RPI) | P32200 | |
| Poly(A)-Schwanzlängen-Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Leiter | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA-Gel-Ladefarbstoff (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA-Mikrovorbereitungskit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA-Miniprep-Kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Schere-Vannas Federschere - 2,5 mm Cutting Edge | Fine Science Werkzeuge | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tabletten | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetat-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
Referenzen
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).....
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Nachdrucke und Genehmigungen
