Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones
Summary
Aplysia californica Neuronen entwickeln große Wachstum Kegel in Kultur, die sich hervorragend für hochauflösende Bildgebung des Wachstums Kegel Motilität und Führung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Beschichtung von Aplysia Tasche Zelle Neuronen sowie für die Einrichtung einer Kammer für Live Cell Imaging.
Abstract
Neuronale Wachstum Kegel sind die sehr beweglichen Strukturen an der Spitze der Axone, die Führung cues in der Umgebung zu erkennen und kann transduzieren diese Informationen in gerichtete Bewegung in Richtung der entsprechenden Zielzelle. Um vollständig zu verstehen, wie Führung Informationen von der Zelloberfläche an die zugrunde liegende Dynamik des Zytoskeletts Netzwerke übertragen, benötigt man ein Modell-System eignet sich für Live Cell Imaging von Protein Dynamik bei hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Typische Wirbeltiere Wachstum Kegel sind zu klein, um quantitativ zu analysieren F-Aktin und Mikrotubuli-Dynamik. Neuronen aus dem Seehasen Aplysia californica sind 5-10 mal größer als Wirbeltiere Neuronen, kann leicht bei Raumtemperatur aufbewahrt werden und sind sehr robust Zellen für Mikromanipulation und biophysikalische Messungen. Ihr Wachstum Kegel sehr zytoplasmatischen Regionen und eine gut beschriebene Zytoskelett-System definiert. Die neuronalen Zellkörpern können mit einer Vielzahl von Sonden zur Untersuchung von Wachstum Kegel Motilität und Führung mikroinjiziert werden. In der vorliegenden Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Präparation des Abdominalganglion, Kultur bag Zelle Neuronen und die Einrichtung eines bildgebenden Kammer für Live Cell Imaging Wachstum Kegel.
Protocol
Discussion
Aplysia Tasche Zelle Neuronen eine serumfreien neuronalen Zellkultur-System mit sehr wenigen nicht-neuronalen Zellen. Diese Neuronen bilden sehr große Wachstum Kegel geeignet, um eine Reihe von wichtigen zellbiologischen Fragestellungen zu beantworten. Bag Zelle Neuronen können leicht manipuliert werden und abgebildet bei Raumtemperatur über mehrere Stunden. Unter Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM) kann man quantitativ zu analysieren die verschiedenen Parameter des F-Aktin und Mikrotubuli-Polymerisation und Translok…
Acknowledgements
Wir möchten Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) für die Dreharbeiten unsere Verfahren und Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) für die Unterstützung bei der Bearbeitung der Dissektion Video danken. Die Forschung im Labor Suter wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS049233) und die Bindley Bioscience-Center an der Purdue University, um DMS unterstützt
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
