Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.
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Methodenartikel
Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.
Einleitung
Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist1. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen2. Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie3. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentrie....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen.
1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung
- Humanes ESC-Nährmedium und Durchgangslösung
- Erhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; siehe Materialtabelle) aseptisch herstellen. 5x Supplement bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Vor Gebrauch gut umrüh....
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Ergebnisse
Eine grafische Übersicht über das geänderte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. H9-ESCs wurden zur Erzeugung von ROs verwendet, wenn die Zellen auf eine Dichte von 70 % bis 80 % gezüchtet wurden. Einzelzellsuspensionen von H9-ESCs in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden aggregierten sich an Tag 1 und bildeten bis Tag 6 gut umschriebene runde EBs. Mit zunehmender Kulturzeit nahm das Volumen der EBs allmählich zu. Am Tag 30 wurden während der langfristigen NR-Differenzierung deutlich ne.......
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Diskussion
Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf15. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative Medizi.......
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Waschscheiben |
| 4 % Paraformaldehyd | Servicebio | G1101-500ML | Fix Netzhaut-Organoide |
| 5 mL Pasteur-Pipette | NEST Biotechnologie | 318516 | Pipette Netzhaut-Organoide |
| 96 konische Vertiefungen mit V-Boden | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhäsionsmikroskop-Objektträger | CITOTEST | 188105 | Fix-Scheiben |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Wasserfreies Ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrierung |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primärantikörper |
| Antifade Lösung | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primärer Antikörper |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primärer Antikörper |
| Antineuronal Klasse III β-Tubulin (TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primärer Antikörper |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primärer Antikörper |
| Zelldissoziationslösung (CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Zelldissoziation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β Hemmer |
| Cholesterin Lipid Konzentrat | Gibco | 12531018 | 250-fach; |
| Citrat Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nukleare Gegenfärbung |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Esel Anti-Maus Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Sekundärantikörper |
| Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Sekundärantikörper |
| Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0,5 M, pH 8,0, Zelldissoziation |
| Extrazelluläre Matrix (ECM) | Corning | 354277 | Beschichtungsplatten |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetales Rinderserum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan-Schnitte |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-Inhibitor |
| KnockOut Serum Ersatz | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-Inhibitor |
| 24-Well-Platten mit geringer Adhäsion | Corning | 3473 | |
| 6-Well-Platten mit geringer Adhäsion | Corning | 3471 | |
| Erhaltungsmedium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 Ergänzung | Gibco | 17502048 | |
| Normales Eselsserum | Solarbio | SL050 | Blocking-Puffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Gewebeeinbettung |
| PBS pH 7,4 basisch (1x) | Gibco | C10010500BT | Ohne Ca+,Mg+ |
| Rekonbinantes menschliches Knochenmorphogenetisches Protein-4(rhBMP4) | R& D | 314-BP | Schlüsselproteinfaktor |
| Retinsäure | Sigma | R2625 | Pulver, vor Licht schützen |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-Inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosinkinase-Inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurin | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma M1753 | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilisierung |
| WA09 embryonale Stammzelllinie | WiCell Research | Institute Zelllinie | |
| Xylol | SINOPHARM | 10023418 | Entparaffinierung |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-Inhibitor |
Referenzen
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
