כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.
Abstract
הזנה היא תהליך ביולוגי חיוני לצמיחה, רבייה והישרדות של אורגניזם. בדיקה זו נועדה למדוד את צריכת המזון של Caenorhabditis elegans (C. elegans), פרמטר חשוב כאשר לומדים את הגנטיקה של הזדקנות או מטבוליזם. ברוב המינים, האכלה נקבעת על ידי מדידת ההפרש בין כמות המזון שסופקה לבין הכמות שנותרה לאחר מרווח זמן נתון. השיטה המוצגת כאן משתמשת באותה אסטרטגיה כדי לקבוע את האכלה של C. elegans. הוא מודד את כמות החיידקים, מקור המזון של C. elegans, שנוקו תוך 72 שעות. שיטה זו משתמשת בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארות ואפשרה סינון של מאות תרופות בשל יכולתן לווסת את צריכת המזון במהירות ובעומק שאינם אפשריים במודלים אחרים של בעלי חיים. כוחה של בדיקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת למדוד האכלה ותוחלת חיים בו זמנית ומודדת ישירות את היעלמות המזון, ולכן מבוססת על אותם עקרונות המשמשים אורגניזמים אחרים, מה שמקל על השוואה בין מינים למינים.
Introduction
Caenorhabditis elegans נמצא בשימוש נרחב בחקר ההזדקנות. זה היה מודל רב עוצמה לחקור את הגנטיקה העומדת בבסיס חילוף החומרים בתיווך אריכות ימים הנגרמת על ידי הגבלה תזונתית, פעילות מיטוכונדריאלית מופחתת, או איתות אינסולין מופחת. 1,2,3,4,5,6,7. עם זאת, מדידת האכלה בהקשר של אריכות ימים הוכחה כקשה עבור C. elegans בשל גודלו הקטן של בעל החיים 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
האכלה היא התנהגות ביולוגית בסיסית הנדרשת להישרדות, והרגולציה ההדוקה שלה נמצאת בליבת השמירה על בריאות מטבולית, רבייה והזדקנות. התנהגות האכלה נשלטת על ידי מסלולי איתות מרובים הן במערכת העצבים והן בפריפריה, ולכן ניתן לחקור אותה רק in vivo 16,17,18,19. האכלה מייצגת את הראשון מבין שלושה עמודי תווך: (i) צריכת אנרגיה, (ii) אחסון אנרגיה, ו-(iii) הוצאות אנרגיה השולטות בהומאוסטזיס האנרגיה של אורגניזם. האכלה ב- C. elegans נחקרה בעיקר על ידי מדידת שאיבת הלוע, כפי שהוגדרה על ידי קצב ההתכווצויות של הלוע. גישה זו סיפקה תובנות מכריעות לגבי התנהגות ההזנה של C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; עם זאת, שאיבת הלוע, הנמדדת במיוחד על פני פרקי זמן קצרים של דקות, אינה בהכרח מתואמת עם צריכת מזון.
צריכת המזון נקבעת לא רק על ידי קצב שאיבת הלוע אלא גם על ידי פרמטרים כגון משך ותדירות התקפי האכלה וצפיפות חיידקי המזון. לבעל חיים עשויה להיות שאיבת לוע גבוהה מאוד, אך אורך התקפי ההאכלה שלו עשוי להיות קצר יותר, ולקזז את הקצב המוגבר. גורם מבלבל נוסף הוא היעילות שבה שאיבה עשויה או לא יכולה לבלוע ולטחון חיידקים. דוגמה קיצונית לשחרור צריכת מזון משאיבת הלוע היא תוספת של סרוטונין ללא נוכחות מזון (חיידקים). בנוכחות סרוטונין אקסוגני, בעלי חיים שואבים בקצב גבוה, אך ללא נוכחות חיידקים, קצב השאיבה הגבוה אינו מוביל לצריכת מזון 2,6,13,22,23.
שיטת פינוי החיידקים שמוצגת כאן מודדת את צריכת המזון של אוכלוסיות תולעים בבארות בודדות כירידה בריכוזי חיידקים לאורך זמן (איור 1). גישה זו דומה לאלה המשמשות במינים אחרים שבהם היעלמות המזון מייצגת מדד לצריכת מזון 10,11,24,25,26,27,28. בפרסום המקורי, תיקפנו שיטה זו למדידת צריכת מזון על ידי הזנת C. elegans עם 15N חיידקים המסומנים באיזוטופ11. מדדים מאוחרים יותר על ידי ספקטרומטריית מסות הראו כי מדידת היעלמותם של חיידקים הייתה בקורלציה חזקה עם התרחשות של תיוג איזוטופים, וחשפה את הספיגה בפועל של החיידקים לתוך החיה11. לכן, אנו בטוחים כי בדיקת פינוי החיידקים מייצגת צריכת מזון ברוב הנסיבות. מטרת הבדיקה אינה להחליף את בדיקת שאיבת הלוע אלא להוסיף לארגז הכלים של בדיקות לחקר הזנה ומטבוליזם ב- C. elegans וכיצד זה קשור להזדקנות ואריכות ימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג מודד פינוי חיידקים כקריאה לצריכת מזון של C. elegans בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארות. עקומות המינון-תגובה בסעיף התוצאות המייצגות מראות כי הבדיקה מודדת כמותית את צריכת המזון, רעיון שאושר באופן עצמאי באמצעות חיידקים המסומנים באיזוטופים11. באמצעות בדיקה זו, בדקנו בהצלחה תרופות שאושרו על ידי ה- FDA כגון תרופות אנטי פסיכוטיות עם תופעות לוואי מטבוליות ידועות בבני אדם והראינו כי תרופות אלה הגבירו את ההזנה ב– C. elegans10,26. הבדיקה שימושית לחקר הגנטיקה או הפרמקולוגיה של האכלה ומוסיפה כלי חדש למחקר C. elegans לחקר חילוף החומרים. בדיקה זו מספקת שיטה בעלות נמוכה לחקר האכלה באופן מדרגי וידידותי לזמן, דבר שאינו אפשרי ברוב האורגניזמים האחרים. העבודה שלנו על תרופות שאושרו על ידי ה- FDA מראה כי תופעות לוואי רבות שנצפו בחולים אנושיים נצפות גם ב- C. elegans, וחושפות שימור אבולוציוני 24,26,32.
הבדיקה מוגבלת על ידי ריכוז החיידקים שניתן למדוד בטווח הליניארי של מדידת OD600 . כתוצאה מכך, מספר התולעים וטווח ריכוזי החיידקים שניתן לבדוק מוגבלים. יותר מדי תולעים ישפיעו על OD600 על ידי צריכת החיידקים מהר מדי, ולכן “אוכלות” את ריכוז החיידקים מתוך OD600 ליניארי. מניסיוננו, שונות בהכנת חיידקים היא הפרמטר הקריטי שגורם לתוצאות להשתנות מניסוי אחד למשנהו. ניסינו ללא הצלחה להקפיא קבוצות גדולות של חיידקים או להשתמש בחיידקים ליופיליים. במקרים אלה, או שקצב הליזה העצמית נעשה גבוה מדי, או שהחיידקים היו באיכות שהאטה את התפתחות C. elegans . עם זאת, הבדיקות שלנו לא היו ממצות, ובעיה זו עשויה להיות פתירה.
באופן כללי, קצב העצמיזציה של החיידקים הוא המאתגר ביותר לשליטה, והוא יכול לגרום לשונות ניכרת. מצאנו כי תרופות מסוימות יכולות להגדיל את שיעור העצמיזציה לרמות שהבדיקה לא הצליחה לקבוע באופן מהימן את צריכת המזון. מכיוון ששיעור העצמיזציה עולה עם הזמן בבדיקה, לא מדדנו את צריכת המזון מעבר ליום 5 לבגרות. בגיל זה, החיידקים נמצאים ~ 10 ימים בתרבית. כדי למדוד את צריכת המזון מעבר ליום 5 לבגרות, יש לשטוף את החיידקים הישנים ולהחליפם בחיידקים טריים.
הבדיקה המוצגת היא הרחבה של בדיקת תוחלת החיים31 המבוססת על לוחות מיקרוטיטר 96 בארות. שילוב זה מאפשר למדוד תוחלת חיים וצריכת מזון באותה אוכלוסייה. בעוד שבדיקת פינוי החיידקים המוצגת כאן אינה מאפשרת לקבוע את צריכת המזון לאורך כל חייו של C. elegans עקב עצמיות חיידקית, היא מספקת נתונים מוצקים עבור ארבעת הימים הראשונים של הבגרות, הזמן עם צריכת המזון הגבוהה ביותר. במיוחד עבור גילוי תרופות מולקולות קטנות, שליטה על צריכת מזון היא חיונית. לסיכום, אנו צופים כי המחקר המוצג יהיה שימושי לקהילת C. elegans וירחיב את סט הכלים לחקר חילוף החומרים או שליטה בו בהקשר של מחקרי הזדקנות ותוחלת חיים.
תכנון:
לפני שמתכננים למדוד את צריכת המזון, יש לקחת בחשבון מספר שיקולים.
הרג החיידקים:
אנו הורגים חיידקים על ידי הקרנה באמצעות קרני רנטגן בצינור חרוטי של 50 מ”ל (900 אפור למשך 4 שעות שנקבע על 160.0 קילו-וולט ו-25.0 מיליאמפר). אנו משתמשים ב-RS2000 של Rad Source להקרנה. בהתאם לציוד, הזמן הספציפי ומינון הקרינה עשויים להשתנות ממתקן למתקן. ההרג המלא של החיידקים צריך להיקבע על ידי ציפוי החיידקים לאחר הקרנה כדי לזהות ניצולים על ידי גדילה. זה חיוני כדי להרוג את כל החיידקים כדי למנוע צמיחה במהלך הבדיקה, כמו זה יגרום הערכת חסר של האכלה או אפילו ערכי האכלה שליליים. חשוב לציין שיש להרוג את החיידקים כדי ש-C. elegans עדיין יאכלו אותם. מניסיוננו, ישנן שלוש דרכים להרוג כמויות גדולות של חיידקים באופן אמין: (i) הקרנה באמצעות קרני רנטגן, (ii) על ידי γ-rays, ו-(iii) תוספת של פורמלדהיד29,30. שיעורי הליזה העצמית בין שלוש השיטות האלה דומים, עם מקדם שונות של 8% בין שיעורי הליזה העצמית בניסויים שמוצגים באיור 3B. שיטות שלא עבדו בידינו בצורה אמינה היו הקרנת UV, קוקטיילים אנטיביוטיים, נטרול חום ונתרן אזיד. שיטות אלה אינן מצליחות להרוג לחלוטין את החיידקים (UV ואנטיביוטיקה), מייצרות חיידקים ש– C. elegans אינו אוכל (חום), או משנות את צריכת המזון (נתרן אזיד).
מספר עותקים משוכפלים:
מניסיוננו, שינויי הקיפול בהאכלה הם בדרך כלל קטנים בהשוואה לשונות הנצפית. לפיכך, מדידת שינויים בצריכת המזון דורשת מספר בארות משוכפלות. איור 2A,B מראה לוחות של 96 בארות שתוכננו עבור ארבעה או שישה תנאים שונים, עם 21 או 14 בארות משוכפלות ושתי בארות לשליטה עצמית ללא תולעים. בהתחשב בשונות הגדולה ובשינויים הקטנים יחסית הצפויים, שינויים של פי 0.5-2.5 בהאכלה נוטים להיות הגבול התחתון והעליון. אנו ממליצים על 14 עד 21 בארות משוכפלות לכל מצב ולפחות שתי בארות בקרת עצמיות, המתוארות בהמשך. שכפולים אלה מספיקים כדי ליצור עקומות מנה-תגובה כמותיות עבור תרופות המשנות את ההזנה11,26.
שליטה בלליזה עצמית:
OD600 מודד את מספר החלקיקים בתמיסה, לרוב ללא תלות בגודל החלקיקים. עם זאת, חיידקים מתים ישככו, ויאבדו את טבע החלקיקים שלהם. אנו קוראים לזה selflysis, אשר מתרחשת באופן עצמאי בנוכחות תולעים ומורידה את מדידות OD600 ללא התולעים לאכול. ליזה עצמית מתרחשת במהלך הבדיקה ויש למדוד אותה באופן עצמאי לפחות בשתי בארות לכל מצב. בארות אלה מקבלות את אותו הטיפול כמו האחרות באותו מצב, אלא שהן אינן מכילות תולעים. מצאנו כי תרופות רבות יכולות גם לשנות את שיעור העצמיזציה. לכן, כל מצב צריך בארות שליטה עצמית עצמאית עם הריכוז שלהם. איור 2 מראה מערך לוחות עבור ארבעה או שישה תנאים עם כל בארות הבקרה של הליזה העצמית בתחתית הצלחת בשורה H.
אוכלוסיית ייחוס N2:
כמו כן, ציינו כי הכמות האבסולוטית של החיידקים הנצרכת יכולה להשתנות בין ניסויים, ככל הנראה הקשורים לאיכות החיידקים. למרות מיטב מאמצינו להכין אותם בדיוק באותו אופן בכל פעם, יש תנודות. לדוגמה, ניתן לקצור חיידקים במצב חלוקה בשלב הגידול הלוגריתמי, ולכן להיות גדולים בהרבה מחיידקים שנקצרו בשלב הנייח. לפיכך, הבדלים פשוטים אלה בגודל החיידקים יכולים להוביל לשינויים במספר החיידקים הנצרכים ולערכי OD600 שונים מכיוון שמדידות OD600 אינן מבחינות בין גדלים. מסיבה זו, אנו תמיד כוללים אוכלוסייה אחת של חיות ביקורת N2 לא מטופלות המשמשות כערך ייחוס, המוגדר ל-1 או 100%, כדי לקבוע אם קבוצות הניסוי אוכלות יותר או פחות מקבוצת הבקרה N2. פרקטיקה זו מאפשרת השוואה בין ניסויים, גם אם ערכי OD600 משתנים.
מרווחי זמן:
שימוש בערכי OD600 למדידת צריכת מזון דורש ירידה ניכרת בריכוז החיידקים. מכיוון שנפח התרבית גדול בהרבה מהתולעים, הן חייבות לאכול כמות משמעותית של חיידקים כדי לחולל שינוי שניתן להבחין בהן. הישארות בטווח הליניארי של ערכי OD600 דורשת שריכוז החיידקים יישאר בין ~1 מ”ג/מ”ל ל-10 מ”ג/מ”ל, כך שכמות ניכרת של חיידקים חייבת להיעלם כדי לזהות אותו. תולעים אוכלות הכי הרבה מסוף L4 עד יום 4 לבגרות בגלל ייצור ביצים. לכן, מרווח זה הוא אידיאלי. מרווחי זמן קצרים יותר כמו 24 שעות ניתן למדוד11, אבל זה הרבה יותר קשה וצריך ~ 40 בארות לכל מצב. אפשרות נוספת למדוד את צריכת המזון של הזחלים היא להכפיל את מספר בעלי החיים בכל באר. עם זאת, הבעיה עם גישה זו היא כי יותר מדי תולעים יתחילו להשפיע על קריאות OD600 כאשר הם גדלים.
פתרונות מלאי לתרופות שייבדקו:
אם תרופות כגון סרוטונין נבדקות על יכולתן לווסת את ההאכלה, שקול את הדברים הבאים בעת הכנת פתרונות מלאי. בדרך כלל אנו מכינים מלאי של פי 50 לתרופות מסיסות במים ומוסיפים 3 מיקרוליטר לכל באר (1:50), אך גם ריכוזי מלאי אחרים (100x, 300x) עובדים. עם זאת, אם התרופות מדוללות בממסים שאינם מים (למשל, DMSO), הריכוז הסופי לא יעלה על 0.5%. ממסים הופכים במהירות מזיקים ל – C. elegans. לפיכך, תמיסות מלאי של תרופות המומסות בממסים אורגניים כגון DMSO חייבות להיות פי 300 ומעלה.
ניקוד תולעים חיות ומתות:
הקביעה של בעלי חיים חיים ומתים מבוססת על תנועת התולעת. אור חזק, במיוחד אור כחול, משמש כי זה גורם לבעלי החיים לנוע. יתר על כן, ניקוד מספר בעלי החיים בכל באר יגלה אם יש מקרי מוות עודפים. מקרי מוות עודפים יכולים להתרחש עם חומרים רעילים או ריכוזים גבוהים (>0.5%) של מספר ממסים, כולל DMSO. באופן כללי, צריכים להיות פחות מ 1:100 (1%) בעלי חיים מתים. ניתן לנער צלחות במשך 30 שניות ב 800 סל”ד על שייקר צלחת microtiter אם האוכל התיישב האוכלוסייה הופך להיות קשה לספור. התעלם מבארות עם זכרים או יותר מ -16 תולעים (ראה בעיות).
בעיות אפשריות:
טלטול לא מספק:
בתווך נוזלי, חיידקים יכולים בקלות להתקבץ יחד ולהתיישב בתחתית הבארות. מניסיוננו, טלטול של פחות מ-20 דקות עלול שלא לפרק גושי חיידקים ולהשהות אותם מחדש, מה שיגרום למדידות OD600 לא מדויקות. מדידות OD600 בנוכחות גושי חיידקים ימעיטו בריכוז החיידקים. הגדרות שייקר מוגזמות עלולות לגרום להידבקות הנוזל לאיטום. לאחר הסרת חומר האיטום לקריאת OD600 , הנוזל שנדבק לאוטם יגרום לקריאת OD600 נמוכה יותר. אם יש נוזל על האטם, סובבו במהירות את הצלחת במהירות נמוכה (500-1,000 סל”ד) ונערו שוב במשך 5 דקות. יתר על כן, יש לוודא, כאמור לגבי הקריאות ביום 1 וביום 4, לקרוא תוך 10 דקות מניעור הצלחות כדי למנוע מהחיידקים לשקוע.
ערכי צריכת מזון מוחלטים שונים בין ניסויים:
למרות מיטב מאמצינו לתקנן את התכשירים החיידקיים, לעתים קרובות הם שונים בדרכים המשפיעות על צריכת המזון בתולעים. לדוגמה, בשל מצב החלוקה שלהם, חיידקים נבדלים בגודלם בהתבסס על האם הם נקטפו בשלב הגידול הלוגריתמי או בשלב הנייח, כאשר החיידקים הלוגריתמיים גדולים יותר. בשל מדידות OD600 שאינן מבחינות בין הגדלים, ההבדלים בגודל החיידקים עקב השלב שבו נקצר החיידק עשויים להוביל להבדלים לכאורה שנצפו בצריכת המזון הבסיסית בין תכשירים חיידקיים. הדרך הטובה ביותר להשוות בין ניסויים היא תמיד לכלול אוכלוסיית ביקורת N2 לא מטופלת ולנרמל את התוצאות לאוכלוסיית N2 זו.
השפעות צפיפות:
ריכוז החיידקים בפרוטוקול זה מספיק כדי לשמור על OD600 בטווח הליניארי עבור 2-16 תולעים לכל באר למשך ~72 שעות. בהתאם לסם המעניין, באר המכילה יותר מ -16 תולעים עלולה לרוקן את ריכוז החיידקים לפני המדידה השנייה. מצאנו גם שבארות עם חיה אחת נוטות להיות לא אמינות. גורם הליזיס עולה על מה שתולעת בודדת אוכלת. לפיכך, טעויות קלות בקביעת גורם הליזיס משפיעות באופן לא פרופורציונלי על בארות עם פחות תולעים.
אנו ממליצים להחריג בארות מניתוחים סטטיסטיים אם אחד התנאים להלן מתקיים. יש זכרים בבאר (אין לנו נתונים המשווים את צריכת המזון בין זכרים להרמפרודיטים); יש פחות מ 2 תולעים בבאר או יותר מ 16 תולעים בבאר; תולעים מתות בקריאה השנייה; או אם יש צאצאים בבארות כי ה-FUdR נכשל. FUdR רגיש לחום ומנוטרל אפילו בטמפרטורות נמוכות עד 37 מעלות צלזיוס. יש להפשיר תמיד את FUdR במים בטמפרטורת החדר.
ערכי צריכת מזון שליליים:
ערכי צריכת המזון הם לעתים שליליים, מה שמרמז על יותר מזון ביום 4 מאשר ביום 1. ערכי צריכת מזון שליליים עשויים להצביע על אחד הגורמים הבאים: שיעור גבוה של ליליזה עצמית , שנגרם אולי על ידי תרופה שנוספה הפועלת על החיידקים, או ערכי צריכת מזון שליליים, אשר עשויים להצביע על כך שהבאר מזוהמת ומשהו אחר מלבד תולעים גדל. שיעורי הליזה העצמית גדלים גם הם ככל שהחיידקים מזדקנים; לכן, אנו ממליצים להשתמש בחיידקים בני לא יותר משבוע. נוספה תרופה שמזרזת עם הזמן, המשפיעה על ערך OD600 . רעידות לא מספיקות ביום הראשון עלולות להוביל לקריאה נמוכה יותר של OD600 עקב גושי חיידקים. התולעים עברו לחץ היפוקסי. זה קורה כאשר יחס פני השטח לאוויר אינו מספיק כדי לאפשר חילופי חמצן. השתמש בצלחת הספציפית של 96 בארות בחומרים ואל תעלה על 150 μL (120 μL + 30 μL של FUdR) לכל באר. המרחק בין פני השטח של הבאר לבין התחתית שבה התולעים חיות קובע את ריכוז החמצן.
מגבלות:
בדיקה זו מוגבלת לתרבית נוזלית. התנהגויות האכלה שנצפו בצלחות מוצקות, כגון תנועה על מדשאות מזון ומחוצה להן, אינן ניתנות להערכה באמצעות הבדיקה.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות ל- Xiaolan Ye, שכן פרוטוקול זה פותח כתוצאה מתצפית שהיא עשתה במקור. אנו מודים לכל חברי מעבדת Petrascheck בעבר ובהווה על עזרתם בפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי R21 AG080376 (ל- M.P). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
|
| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
|
| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
|
| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
|
Referenzen
- Taormina, G., Mirisola, M. G. Calorie restriction in mammals and simple model organisms. Biomed Res Int. 2014, 308690 (2014).
- Cunningham, K. A., et al. Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C. elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).
- You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C. elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetik. 141 (4), 1399-1406 (1995).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span. Cell. 95 (2), 199-210 (1998).
- Srinivasan, S. Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C. elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).
- Calculli, G., et al. Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of. elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012 (2021).
- Avery, L. The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans. Genetik. 133 (4), 897-917 (1993).
- Wu, Z., et al. Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity. Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).
- Chen, A. L., et al. Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan. Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).
- Gomez-Amaro, R. L., et al. Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans. Genetik. 200 (2), 443-454 (2015).
- Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx. Genetik. 166 (1), 161-169 (2004).
- Hobson, R. J., et al. Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying. Genetik. 172 (1), 159-169 (2006).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Webster, C. M., et al. Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival. Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).
- Reis Rodrigues, P., et al. Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).
- Levichev, A., et al. The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C. elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).
- Wang, D., et al. Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system. Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).
- Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. An opioid-like system regulating feeding behavior in C. elegans. Elife. 4, e06683 (2015).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).
- Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).
- Witham, E., et al. C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves. Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).
- Hussey, R., et al. Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (3), e1007305 (2018).
- Zapata, R. C., et al. Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase. Nat Commun. 13 (1), 5092 (2022).
- Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation. Elife. 12, e76465 (2023).
- Perez-Gomez, A., et al. A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia. Nat Commun. 9 (1), 5272 (2018).
- Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity. J Vis Exp. (172), 62775 (2021).
- Zapata, R. C., et al. Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight. Mol Metab. 76, 101794 (2023).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Commun Biol. 3 (1), 653 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology. MicroPubl Biol. 2023, (2023).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. Drug-induced metabolic syndrome. J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).
