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Methodenartikel

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

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DOI:

10.3791/66426

⸱

9. Februar 2024

 ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.

Zusammenfassung

Der an den Menschen angepasste bakterielle Erreger Shigella verursacht jedes Jahr Millionen von Infektionen, erzeugt langfristige Wachstumseffekte bei pädiatrischen Patienten und ist weltweit eine der Hauptursachen für Durchfalltode. Eine Infektion führt zu wässrigem oder blutigem Durchfall, da der Erreger den Magen-Darm-Trakt durchquert und die Epithelzellen infiziert, die den Dickdarm auskleiden. Angesichts der erschütternden Zunahme von Antibiotikaresistenzen und des derzeitigen Mangels an zugelassenen Impfstoffen sind standardisierte Forschungsprotokolle für die Untersuchung dieses gewaltigen Erregers von entscheidender Bedeutung. Hier werden Methoden vorgestellt, um die molekulare Pathogenese von Shigella anhand von In-vitro-Analysen der bakteriellen Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation in Dickdarmepithelzellen zu untersuchen. Vor Infektionsanalysen wurde der Virulenzphänotyp der Shigella-Kolonien durch die Aufnahme des Kongorotfarbstoffs auf Agarplatten verifiziert. Supplementierte Labormedien können auch während der Bakterienkultivierung in Betracht gezogen werden, um In-vivo-Bedingungen nachzuahmen. Bakterienzellen werden dann in einem standardisierten Protokoll verwendet, um Dickdarmepithelzellen in Gewebekulturplatten bei einer etablierten Infektionsvielfalt mit Anpassungen zur Analyse jedes Infektionsstadiums zu infizieren. Für Adhärenz-Assays werden Shigella-Zellen mit reduzierten Medienkonzentrationen inkubiert, um den bakteriellen Kontakt mit Epithelzellen zu fördern. Sowohl für Invasions- als auch für intrazelluläre Replikationsassays wird Gentamicin in verschiedenen Zeitintervallen angewendet, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren und die Beurteilung der Invasion und/oder die Quantifizierung intrazellulärer Replikationsraten zu ermöglichen. Alle Infektionsprotokolle zählen adhärente, eingedrungene und/oder intrazelluläre Bakterien auf, indem infizierte Epithelzelllysate seriell verdünnt und bakterielle koloniebildende Einheiten relativ zu den Infektionstitern auf Kongo-Rotagarplatten plattiert werden. Zusammen ermöglichen diese Protokolle eine unabhängige Charakterisierung und Vergleiche für jedes Stadium der Shigella-Infektion von Epithelzellen, um diesen Erreger erfolgreich zu untersuchen.

Einleitung

Durchfallerkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, sind eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung. Im Jahr 2016 waren Durchfallerkrankungen weltweit für 1,3 Millionen Todesfälle verantwortlich und waren die vierthäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren 1,2. Der gramnegative, enterische bakterielle Erreger Shigella ist der Erreger der Shigellose, einer der Hauptursachen für Durchfalltodesfälle weltweit3. Shigellose verursacht jedes Jahr eine signifikante Morbidität und Mortalität bei Kindern aus Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen 4,5, während Infektionen in Ländern mit hohem Einkommen mit Ausbrüchen in Kindertagesstätten, lebensmittelbedingten und wasserbedingten Ausbrüchen zusammenhängen 6,7,8,9. Die ineffektive Entwicklung von Impfstoffen 10 und die steigenden Raten von Antibiotikaresistenzen (AMR)11,12 haben das Management von großflächigen Shigella-Ausbrüchen erschwert. Jüngste Daten der Centers for Disease Control and Prevention zeigen, dass fast 46 % der Shigella-Infektionen in den Vereinigten Staaten im Jahr 2020 eine Arzneimittelresistenz aufwiesen13,14, während die Weltgesundheitsorganisation Shigella zu einem vorrangigen AMR-Erreger erklärt hat, für den dringend neue Therapien benötigt werden15.

Shigella-Infektionen werden leicht über den fäkal-oralen Weg übertragen, wenn kontaminierte Lebensmittel oder Wasser aufgenommen werden, oder durch direkten menschlichen Kontakt. Shigella hat sich zu einem effizienten, an den Menschen angepassten Krankheitserreger entwickelt, mit einer infektiösen Dosis von 10-100 Bakterien, die ausreicht, um Krankheiten zu verursachen16. Während der Dünndarmpassage ist Shigella Umweltsignalen wie erhöhter Temperatur und Galleausgesetzt 17. Der Nachweis dieser Signale induziert transkriptionelle Veränderungen, um Virulenzfaktoren zu exprimieren, die die Fähigkeit der Bakterien verbessern, den menschlichen Dickdarm zu infizieren 17,18,19. Shigella dringt nicht von der apikalen Oberfläche in das Dickdarmepithel ein, sondern durchquert die Epithelschicht und folgt der Aufnahme in spezialisierte antigenpräsentierende Mikrofaltenzellen (M-Zellen) innerhalb des follikelassoziierten Epithels 20,21,22. Nach der Transzytose werden Shigella-Zellen von residenten Makrophagen phagozytiert. Shigella entkommt schnell dem Phagosom und löst den Zelltod der Makrophagen aus, was zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt 5,23,24. Shigella dringt dann von der basolateralen Seite in Dickdarmepithelzellen ein, lysiert die makropinozytäre Vakuole und etabliert eine replikative Nische im Zytoplasma 5,25. Proinflammatorische Zytokine, insbesondere Interleukin-8 (IL-8), rekrutieren polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) an den Ort der Infektion, was die epithelialen Tight Junctions schwächt und eine bakterielle Infiltration der Epithelaushaut ermöglicht, um die basolaterale Infektion zu verschlimmern5. Die PMNs zerstören die infizierte Epithelschleimhaut, um die Infektion einzudämmen, was zu den charakteristischen Symptomen einer bazillären (blutigen) Ruhr führt5. Obwohl die Invasions- und intrazellulären Replikationsmechanismen gründlich charakterisiert wurden, zeigen neue Forschungsergebnisse wichtige neue Konzepte bei Shigella-Infektionen, einschließlich der Virulenzregulation während des gastrointestinalen (GI) Transits17, der Adhärenz19, des verbesserten basolateralen Zugangs durch Barrierepermeabilität26 und der asymptomatischen Übertragung bei unterernährten Kindern27.

Die Fähigkeit von Shigella spp., Durchfallerkrankungen zu verursachen, ist auf Menschen und nicht-menschliche Primaten (NHP) beschränkt28. Shigella-Darminfektionsmodelle wurden für Zebrafische29, Mäuse30, Meerschweinchen31, Kaninchen21, 32, 33 und Schweine34, 35 entwickelt. Keines dieser Modellsysteme kann jedoch die während einer menschlichen Infektion beobachteten Krankheitsmerkmale genau reproduzieren36. Obwohl NHP-Modelle der Shigellose zur Untersuchung der Shigella-Pathogenese etabliert wurden, sind diese Modellsysteme teuer in der Implementierung und erfordern künstlich hohe infektiöse Dosen, die bis zu neun Größenordnungen höher sind als die infektiöse Dosis des Menschen 37,38,39,40,41,42. Daher erfordert die bemerkenswerte Anpassung von Shigella an die Infektion menschlicher Wirte die Verwendung von Zellkulturen menschlichen Ursprungs, um physiologisch relevante Modelle für eine genaue Untersuchung der Shigella-Pathogenese zu erstellen.

Hier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um die Raten der Shigella-Adhärenz, Invasion und Replikation innerhalb von HT-29-Dickdarmepithelzellen zu messen. Mit diesen standardisierten Protokollen können die molekularen Mechanismen, durch die bakterielle Virulenzgene und Umweltsignale jeden Schritt der Shigella-Infektion beeinflussen, untersucht werden, um die dynamische Wirt-Pathogen-Interaktionsbeziehung besser zu verstehen.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.

  1. TSB-Medium: 0,5 l deionisiertes (DI) Wasser zu 15 g Medium Tryptische Sojabrühe (TSB, siehe Materialtabelle) geben und autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
  2. Gallensalzmedium (TSB + BS): Zur Herstellung von TSB mit 0,4 % (w/v) Gallensalzen werden 0,06 g Gallensalze (BS, siehe Materialtabelle) in 15 ml autoklaviertem TSB resuspendiert. Filtersterilisation mit einem 0,22 μm PES-Filter.
    HINWEIS: Die Gallensalze bestehen aus einer 1:1-Mischung aus Natriumcholat und Natriumdesoxycholat. Bereiten Sie frische Medien unmittelbar vor der Verwendung vor.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Fügen Sie 5 ml fötales Kälberserum (FBS) zu 45 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu. Bei 4 °C lagern.
  4. DMEM + Gentamicin: Geben Sie 50 ml DMEM und 50 μl 50 mg/ml Gentamicin in ein 50-ml-Röhrchen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Vor jedem Versuch frisches Aliquot herstellen und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Fügen Sie 150 μl Triton X-100 zu 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
    HINWEIS: Vor jedem Versuch frisches Aliquot herstellen und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
  6. TSB + Kongorot-Indikatorplatten: Geben Sie 15 g TSB, 7,5 g ausgewähltes Agar und 0,125 g Kongorotfarbstoff (siehe Materialtabelle) in eine 1-Liter-Flasche. 0,5 l DI-Wasser hinzufügen und autoklavieren. Gießen Sie 10-20 ml Medium in einzelne sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie es erstarren.
    ACHTUNG: Kongorot ist krebserregend und ein Fortpflanzungsgift. Stellen Sie sicher, dass der Umgang mit Kongorot mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung erfolgt. Weitere Informationen finden Sie im Produktsicherheitsdatenblatt.
    HINWEIS: Ungefähr 20 Teller werden aus 0,5 l kongolesischen roten Medien hergestellt. Die Teller können 2-3 Tage im Voraus zubereitet und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur umgedreht belassen werden. Für die Langzeitlagerung Lege umgedrehte Platten bis zu 3 Monate bei 4 °C in Kunststoffhüllen.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS und 5% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO): Geben Sie 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS und 2,5 ml DMSO in ein 50-ml-Röhrchen. Bei 4 °C lagern.

2. Vorbereitung von Bakterien

HINWEIS: Alle Shigella-Laborkultivierungs - und Lagerungsprotokolle wurden von Payne, S. M.43 übernommen.

ACHTUNG: Shigella spp. sind Erreger der Risikogruppe 244. Führen Sie alle Laborarbeiten in einer BSL-2-Umgebung durch, wobei zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen ergriffen werden, um versehentliche Expositionen aufgrund der niedrigen infektiösen Dosis von Shigella spp. zu begrenzen.

  1. Wachstum von Shigella aus Tiefkühlbeständen
    1. Übertragen Sie eine kleine Menge gefrorener Kultur aus dem kryogenen Fläschchen mit einem sterilen Applikator auf eine TSB + Kongo-Rotagarplatte.
    2. Flammsterilisieren Sie eine Impfschlaufe und lassen Sie sie abkühlen. Streifen Sie das Inokulum über einen Quadranten der Platte hin und her. Entflammen Sie die Schlaufe, lassen Sie sie abkühlen und streifen Sie dann vom ersten Quadranten auf den zweiten Quadranten der Platte. Wiederholen Sie den Vorgang, um das Inokulum in den dritten und vierten Quadranten der Platte zu streifen.
      HINWEIS: Alternativ können Sie das Inokulum mit einem frischen sterilen Applikator zwischen den einzelnen Quadranten streifen.
    3. Die Platte umdrehen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Für die Expression von Shigella-Virulenzfaktoren , die für die Beobachtung des Kongo-Rot-positiven (CR+) Phänotyps45 erforderlich sind, ist eine Inkubation bei Temperaturen ≥37 °C erforderlich. Avirulente Kolonien haben ein weißes Aussehen und sind nicht invasiv.
    4. Die Platte mit Paraffinfolie verschließen und gekühlt bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Bakterienkolonien bleiben auf Agarplatten 1-2 Wochen lebensfähig.
  2. Wachstum von Shigella über Nacht in Flüssigkultur
    1. Aliquotieren Sie 3 ml TSB-Medien in sterile 14-ml-Kulturröhrchen.
    2. Wählen Sie eine einzelne, gut isolierte rote (CR+) Kolonie mit einem sterilen Applikator und resuspendieren Sie sie in flüssigen Medien.
    3. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht (16-18 h) bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 250 Umdrehungen pro Minute (U/min).

3. Herstellung von eukaryotischen HT-29-Zellen

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein. HT-29-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Die HT-29-Wartungsprotokolle wurden von den ATCC-Empfehlungen46 übernommen. Alle Medien sollten vor der Verwendung in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt werden. Alle HT-29-Wartungsprotokolle sollten in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen/Arbeiten mit HT-29-Zellen in Medien, um dramatische pH-Änderungen zu vermeiden.

  1. Auftauen von HT-29-Zellen aus gefrorenem Bestand
    1. Tauen Sie die Durchstechflasche mit HT-29-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
      Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Kappe vollständig über dem Wasser bleibt, um eine Kontamination zu vermeiden. Das Auftauen sollte weniger als 2 Minuten dauern.
    2. Nehmen Sie das Fläschchen sofort nach dem vollständigen Auftauen der Kultur aus dem Wasser und dekontaminieren Sie es mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ab diesem Zeitpunkt mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
    3. Geben Sie den gesamten Inhalt der Durchstechflasche in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 9 ml DMEM + 10 % FBS. Bei 125 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    4. Dekantieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml warmem DMEM + 10% FBS. Resuspendierte Zellen werden in einen 75 cm2 Gewebekulturkolben (T75) mit 10 ml warmem DMEM + 10 % FBS (Gesamtvolumen von 20 ml) überführt.
    5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 , bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen (ca. 6-7 Tage).
      HINWEIS: Die Konfluenz wird durch visuelle Annäherung geschätzt.
  2. Aussaat von HT-29-Zellen
    1. 20 ml PBS und 50 ml DMEM + 10 % FBS in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen und 3 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur vorwärmen.
    2. Sobald die HT-29-Zellen (aus Schritt 3.1) eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, wird das HT-29-Zellkulturmedium aus dem T75-Kolben in einen Abfallbehälter umgefüllt. Gießen Sie ~10 ml warmes PBS in den Kolben und schwenken Sie ihn vorsichtig zum Waschen. Dekantieren Sie das PBS in einen Abfallbehälter. Nochmals mit warmem PBS waschen und dekantieren.
    3. Fügen Sie 2-3 ml 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA hinzu und schwenken Sie es vorsichtig über die gesamte Oberfläche. Bei 37 °C mit 5 % CO2 4 min inkubieren.
    4. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und schwenken Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen von der Oberfläche lösen.
    5. Fügen Sie sofort 6 ml warmes DMEM + 10% FBS hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren. Piptieren Sie auf und ab, um gründlich zu mischen.
    6. Den gesamten Inhalt in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und bei 500 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur schleudern.
    7. Überstand vorsichtig in einen Abfallbehälter umfüllen und das Pellet in 6 ml warmem DMEM + 10 % FBS resuspendieren.
    8. Unmittelbar nach der Resuspension werden 10 μl suspendierte HT-29-Zellen aus der Mitte der Kultur in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen überführt. Geben Sie 10 μl Trypanblau-Farbstoff in das PCR-Röhrchen und mischen Sie.
    9. Geben Sie 10 μl HT-29-Zell-/Trypanblau-Mischung in einen Einweg-Countess-Zell-Gegenkammerobjektträger (siehe Materialtabelle). Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
      HINWEIS: Wenn Sie die Anzahl der Zellen in der Stichprobe dokumentieren, lesen Sie die Zahl unter der "Live"-Zellzahl, nicht die Gesamtzellenzahl. Alternativ kann die Zellzählung manuell mit einem Hämozytometer durchgeführt werden.
    10. Resuspendierte HT-29-Zellen in einen frischen T75-Kolben oder eine 6-Well-Platte.
      1. Für T75-Kolben:
        1. Zum Mischen vorsichtig pipettieren, dann 2,5 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in einen frischen T75-Kolben umfüllen:
          figure-protocol-1
        2. Fügen Sie warmes DMEM + 10% FBS-Medium zu einem Endvolumen von 20 ml hinzu (Endkonzentration von 1,25 x 105 Zellen/ml).
        3. Die Zellen werden gleichmäßig über den Kolben verteilt, indem sie sanft hin und her geschaukelt werden.
        4. Bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.
          HINWEIS: Für ein optimales Wachstum ersetzen Sie das DMEM + 10% FBS-Medium im T75-Kolben alle ~3 Tage. Dekantieren Sie das Medium in einen Abfallbehälter und geben Sie 10 ml warmes PBS in den Kolben. Schwenken Sie das PBS vorsichtig herum und füllen Sie es in den Abfallbehälter um. Dann 20 ml frisches, warmes DMEM + 10 % FBS in den Kolben geben und in den 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator zurückgeben.
      2. Für 6-Well-Platte:
        1. Pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und übertragen Sie dann 5,85 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen:
          figure-protocol-2
        2. Fügen Sie warmes DMEM + 10% FBS-Medium zu einem Endvolumen von 26 ml hinzu (Endkonzentration von 2,25 x 105 Zellen/ml).
        3. Pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und geben Sie dann 2 ml (4,5 x 105 Zellen) in einzelne Wells mit 6-Well-Platten.
        4. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung, indem Sie 2-3x sanft nach oben/unten und links/rechts schaukeln.
        5. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 , bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 95 % erreichen (ca. 3-4 Tage).
          HINWEIS: Für Invasions- und intrazelluläre Replikationsassays wird eine Konfluenz von 85 % empfohlen, während für Adhärenzassays eine Konfluenz von 90 % bis 95 % empfohlen wird. Die Zellen sollten nach 48 h Inkubation eine Konfluenz von ~85% erreichen, mit einer Endkonzentration von ca. 1 x 106 Zellen/Well. Anpassungen der Anzahl der ausgesäten Zellen und der Inkubationsdauer können erforderlich sein.
  3. Herstellung von gefrorenen HT-29-Beständen
    1. Aliquotieren Sie 1 ml DMEM + 10 % FBS + 5 % DMSO-Medien in einzelne kryogene Fläschchen.
    2. Geben Sie 1 x 106 HT-29-Zellen aus Schritt 3.2.7 in jede Durchstechflasche. Berechnen Sie das Volumen der Zellen gemäß der folgenden Formel:
      figure-protocol-3
    3. Lagern Sie HT-29-Zellen langfristig unter -130 °C im Flüssigstickstoffdampf-Lagergefrierschrank.

4. Adhärenz-Assay

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.

  1. Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
    1. Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
      Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten.
    2. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min, bis die Zellen eine optische Dichte (OD600) von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
      HINWEIS: Aliquotieren Sie während der Subkultur 50 ml DMEM und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
  2. Übertragen Sie 2 x 108 koloniebildende Einheiten (KBE) subkultivierte Shigellen in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern.
  3. Waschen Sie jede Shigella-Probe 2x mit PBS.
    1. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
    2. Wiederholen Sie Schritt 4.3.1 1x weitere Zeit.
    3. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
  4. Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten geben (aus Schritt 3.2.10.2).
    HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigella in warmem DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml warmem DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) auf HT-29-Zellen auftragen.
  5. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 für 3 h.
  6. Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
    1. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 4.3.3) in PBS vor.
    2. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
  7. Waschen Sie die Monolayer nach der Inkubation 4-5x mit PBS.
    1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
      HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden.
    2. Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
      Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 4.7.1 und 4.7.2 4x weitere Male.
  8. Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
  9. Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
  10. Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
  11. Bestimmen Sie die Anzahl der zellassoziierten Bakterien.
    1. Wirbeln Sie jedes Röhrchen (aus Schritt 4.10) mindestens 30 s lang, um Shigella weiter aus den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
    2. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
    3. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 entspricht einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1 x 10-3, 1 x 10-4 bzw. 1 x 10-5.

5. Invasions-Assay

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.

  1. Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
    1. Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
      Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten.
    2. Bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren, bis die Zellen einen OD600 von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
      HINWEIS: Während der Subkultur aliquotieren Sie 50 ml DMEM + 50 mg/ml Gentamicin und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
  2. 2 x 108 KBE, subkultivierte Shigella in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern.
  3. Shigella-Proben 1x mit PBS waschen.
    1. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
    2. Wiederholen Sie Schritt 5.3.1. 1x zusätzliche Zeit.
    3. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
  4. Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella plus 1 ml DMEM in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten (aus Schritt 3.2.10.2).
    HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigellen in DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) zu HT-29-Zellen hinzufügen.
  5. Um den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen zu fördern, zentrifugieren Sie die 6-Well-Platten bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur oder 37 °C, wenn die Temperatureinstellung angepasst werden kann.
    HINWEIS: Die Zentrifugation fördert den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen, wodurch die Notwendigkeit von Adhärenzfaktoren umgangen wird und die Bakterien schnell in die Zellen eindringen können.
  6. 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 45 min inkubieren.
  7. Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
    1. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 5.3.3) in PBS vor.
    2. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
  8. Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
      HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden.
    2. Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
      Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 5.8.1 und 5.8.2 2x weitere Male.
  9. PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 30 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  10. Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Waschschritt 5.8 wiederholen.
  11. PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 60 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  12. Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Waschschritt 5.8 wiederholen.
  13. Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
  14. Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
  15. Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
  16. Bestimmen Sie die Anzahl der intrazellulären Bakterien.
    1. Wirbeln Sie jedes Röhrchen (ab Schritt 5.15) mindestens 30 s lang, um Shigella weiter von den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
    2. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
    3. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2 und 1 x 10-3 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2 und 1 x 10-3 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-3 bzw. 1 x 10-4.

6. Intrazellulärer Replikationsassay

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.

  1. Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
    1. Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
      Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten.
    2. Bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren, bis die Zellen einen OD600 von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
      HINWEIS: Während der Subkultur aliquotieren Sie 50 ml DMEM + 50 mg/ml Gentamicin und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
  2. 2 x 108 KBE, subkultivierte Shigella in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern.
  3. Shigella-Proben 1x mit PBS waschen.
    1. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
    2. Wiederholen Sie Schritt 6.3.1. 1x zusätzliche Zeit.
    3. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
  4. Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella plus 1 ml DMEM in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten geben (aus Schritt 3.2.10.2).
    HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigellen in DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) auf HT-29-Zellen auftragen.
  5. Um den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen zu fördern, zentrifugieren Sie die 6-Well-Platten bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur oder 37 °C, wenn die Temperatureinstellung angepasst werden kann.
    HINWEIS: Die Zentrifugation fördert den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen, wodurch die Notwendigkeit von Adhärenzfaktoren umgangen wird und die Bakterien schnell in die Zellen eindringen können.
  6. 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 45 min inkubieren.
  7. Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
    1. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 6.3.3) in PBS vor.
    2. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
  8. Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
      HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden.
    2. Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
      Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.8.1 und 6.8.2 2x weitere Male.
  9. PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 30 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  10. Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Waschschritt 6.8 wiederholen.
  11. Entfernen Sie PBS durch Aspiration, geben Sie dann 2 ml warmes DMEM mit 50 μg/ml Gentamicin in jede Vertiefung der 6-Well-Platten und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 für die gewünschte Zeitspanne, um eine intrazelluläre Replikation (bis zu 24 Stunden) zu ermöglichen.
  12. Waschen Sie die Zellen 2x gründlich mit 1 ml PBS.
    1. Waschschritt 6.8 wiederholen.
  13. Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
  14. Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
  15. Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
  16. Bestimmen Sie die Anzahl der intrazellulären Bakterien.
    1. Jedes Röhrchen (ab Schritt 6.15) mindestens 30 s lang wirbeln, um Shigella weiter aus den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
    2. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
    3. 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 auf TSB + Congo Red Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 entspricht einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1 x 10-3, 1 x 10-4 bzw. 1 x 10-5.

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Ergebnisse

Adhärenz-, Invasions- und intrazelluläre Replikationsassays wurden durchgeführt, um den Wildtyp (WT) von S. flexneri 2457T mit S. flexneri ΔVF (ΔVF) zu vergleichen, einer Mutante, von der angenommen wird, dass sie die Virulenz von Shigella negativ reguliert. Da Shigella Gallensalze als Signal zur Regulierung der Virulenz verwendet 17,18,47, wurden Experimente nach bakterieller Subkultur in TSB-Medien sowie TSB durchgeführt, das mit 0,4% (w/v) Gallensalzen ergänzt wurde

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von drei standardisierten Assays zur Untersuchung der Shigella-Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation von Darmepithelzellen. Obwohl es sich bei diesen Methoden lediglich um modifizierte Versionen klassischer Gentamicin-Assays handelt, die zur Untersuchung der Invasion und intrazellulären Replikation verschiedener bakterieller Krankheitserreger in Wirtszellen verwendet werden 49,50,51, müssen bei der Untersuchung von

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Unterstützung der Autoren umfasst die Abteilung für Pädiatrie des Massachusetts General Hospital, den Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) Award 2022A009041, den National Institute of Allergy and Infectious Diseases Grant R21AI146405 und den National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μm m PES-FilterMillipore-Sigma SCGP00525Steriler Polyethersulfon-Filter zur Sterilisation von Medien bis zu 50 mL 14
mL KulturröhrchenCorning35205917 mm x 100 mm Polypropylen-Reagenzgläser mit Kappe
50 mL konische RöhrchenCorning43082950 mL Zentrifugenröhrchen aus klarem Polypropylen mit konischem Boden und auslaufsicherer Kappe
6-Well-GewebekulturplattenCorning3516Die Platten sind für eine optimale Zelladhäsion behandelt
GallensalzeSigma-AldrichB87561:1 Verhältnis von Cholat zu Desoxycholat
Kongorot-FarbstoffSigma-AldrichC6277Ein anionischer Diazofarbstoff auf Benzidinbasis mit einer Reinheit von >85 %
Countess Zellzählkammer-ObjektträgerInvitrogenC10283Zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418A, ein hochpolares organisches Reagenz
Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM wird mit hohem Glukosegehalt, Natriumpyruvat, GlutaMAX und Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)ergänztSigma-AldrichF4135Hitzeinaktiviertes, steriles
GentamicinSigma-AldrichG3632Stammkonzentration beträgt 50 mg/ml
HT-29 ZelllinieATCCHTB-38Adenokarzinom-Zelllinie; kolorektal in Herkunft
ParaffinfolieBemisPM999Labor-Siegelfolie
PetrischalenThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Petrischalen für feste
Medien Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x Konzentration; pH 7,4
Select AgarInvitrogen30391023Eine Mischung aus Polysacchariden, die aus Zellwänden von Rotalgen extrahiert werden, um bakterielle Beschichtungsmedien
herzustellen T75-KolbenCorning430641UGewebekulturkolben
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Ein gängiges nichtionisches Tensid und Emulgator 
Trypanblau-FleckInvitrogenT10282Ein Farbstoff zum Nachweis toter Gewebekulturzellen; nur lebende Zellen können den Farbstoff ausschließen
Trypsin-EDTAGibco25200-056Reagenz zur Zelldissoziation zur Erhaltung und Passage von Zelllinien
Tryptische Sojabrühe (TSB)Sigma-AldrichT8907Bakterielle Wachstumsmedien

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