Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit
Summary
We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.
Abstract
De optokinetische reflex (OKR) is een eenvoudige visuele reflex tentoongesteld door de meeste gewervelde dieren en speelt een belangrijke rol bij het stabiliseren van het oog ten opzichte van de visuele scène. Echter, de OKR vereist dat een dier te detecteren bewegen strepen en het is mogelijk dat vissen die niet aan een OKR tentoonstelling niet helemaal blind. Een zebravis mutant, de no optokinetische antwoord c (NRC) heeft geen OKR onder alle lichtomstandigheden getest en was naar verluidt volledig blind. Eerder hebben we aangetoond dat de OFF-ganglion cel-activiteit kan worden opgenomen in deze mutanten. Om te bepalen of mutant vissen zonder OKR, zoals de NRC mutant kan simpel licht stappen en verlaagt ontwikkelden we de visuele motorische gedrag assay (VMR) te detecteren. In deze test, zijn enkele zebravis larven geplaatst in elke well van een 96-wells plaat waarmee de gelijktijdige controle van de larven met behulp van een geautomatiseerd video-tracking systeem. Het bewegingsapparaat reacties van elke larve tot 30 minuten licht aan en 30 minuten het licht uit werden geregistreerd en gekwantificeerd. WT vissen hebben een korte piek van de motorische activiteit bij de verlichting aan, bekend als de schrikreactie, gevolgd door een terugkeer naar een lager dan baseline activiteit, een zogenaamde bevriezen. WT vis ook sterk onmiddellijk verhogen hun locomotorische activiteit volgende lichten UIT en slechts geleidelijk (over enkele minuten) terug te keren naar de uitgangswaarde locomotorische activiteit. Het NRC mutanten dezelfde reageren op OFF licht als WT vis, maar vertonen een lichte daling van hun gemiddelde activiteit in vergelijking met WT vissen. Motorische activiteit als reactie op ON licht in NRC mutanten is vertraagd en traag. Er is een langzame stijging tijd van het NRC mutant reactie op licht ON in vergelijking met WT het licht van de respons. De resultaten geven aan dat NRC vis niet volledig blind. Omdat teleosten kunnen detecteren door middel van niet-retinale weefsel, we bevestigd dat de directe gedragsmatige reacties op licht-intensiteit verandert intact ogen nodig met behulp van de chokh (CHK) mutanten, die geheel ontbreekt ogen vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling. In onze VMR test, de chk mutanten vertonen geen schrikreactie ofwel licht aan of uit, waaruit blijkt dat de laterale ogen dit gedrag te bemiddelen. De VMR test hier beschreven een aanvulling op de gevestigde OKR assay, die niet testen het vermogen van zebravis larven om te reageren op veranderingen in lichtintensiteit. Bovendien is de automatisering van de VMR test leent zich voor high-throughput screening voor defecten in het licht-intensiteit driven visuele reacties.
Protocol
Discussion
De experimentele procedures die we zien in de film zijn alle representatieve van WT vis. Echter, deze experimenten analoog worden gedaan op mutant vis maar ook (zie de vertegenwoordiger resultaat sectie). We stellen voor om plaat WT vis en mutant vis op dezelfde plaat in een dambord schets voor een optimale controle doeleinden.
Bij het gebruik van gemuteerde vis op dezelfde plaat als WT vis zorgen ervoor dat u opschrijven wat voor soort vis werd uitgeplaat in elk putje. Hier is een suggestie over hoe te houden van de vis uitgeplaat …
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health Subsidies EY0081 en 5T32UY07145 en door de Tempeliers Eye Foundation. Jason Rihel is een Bristol-Squibb Fellow van de Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
Referenzen
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
