Zebrafisch-Kardiomyopathie-Modell: Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität

- Kardiomyopathie ist eine Erkrankung, bei der der Herzmuskel geschwächt wird und die Fähigkeit verliert, Blut zu pumpen. Dieser Zustand kann beim Zebrafisch repliziert werden. Zuerst wird eine Stammlösung eines Arzneimittels, das für die Kardiotoxizität verantwortlich ist, in Hanks' ausgewogener Salzlösung verdünnt, um mehrere Arbeitskonzentrationen herzustellen. Legen Sie als Nächstes einen mit Tricain betäubten Fisch mit der Bauchseite nach oben auf einen Halteschwamm unter einem Präpariermikroskop. Positionieren Sie die Nadel zwischen den Beckenflossen in einem 45-Grad-Winkel von der Horizontalen.

Schieben Sie nun die Nadel vorsichtig 1 bis 2 Millimeter in die Bauchhöhle und injizieren Sie langsam die Wirkstofflösung. Warten Sie fünf Sekunden, bevor Sie die Nadel herausziehen, um zu verhindern, dass die Lösung ausläuft. Setzen Sie den Fisch sofort in ein sauberes Aquarium mit frischem Systemwasser um. Notieren Sie die Anzahl der Fische, die jeden Tag aufgrund schwerer Kardiotoxizität oder Schädigung des Herzmuskels sterben. Das Medikament bindet an Todesrezeptoren, die auf der Zellmembran der Kardiomyozyten vorhanden sind, und löst Apoptose aus, was zu einer schweren Kardiotoxizität führt.

Erstellen Sie eine Überlebenskurve, ein Diagramm, das die Überlebenswahrscheinlichkeit im Laufe der Zeit für jede Arzneimittelkonzentration anzeigt. In diesem Beispiel injizieren wir Doxorubicin oder DOX, um bei einem erwachsenen Zebrafisch auf zwei Arten eine Kardiomyopathie auszulösen.

Bevor Sie dem Fisch DOX injizieren, fasten Sie den Fisch 24 Stunden lang. Als nächstes gruppieren Sie die Fische. Verwenden Sie während der Betäubung ein sauberes Filterpapier, um jeden Fisch zu trocknen und sein Körpergewicht zu messen. Stellen Sie Gruppen von Fischen zusammen, die alle innerhalb von 10 % des gleichen Körpergewichts liegen, damit jede Gruppe mit der gleichen Dosis DOX injiziert werden kann. Berechnen Sie als Nächstes die Arbeitskonzentration von DOX für jede Gruppe, so dass jede Gruppe mit fünf Mikrolitern Lösung injiziert wird und die gleiche Dosis DOX nach Körpergewicht erhält.

Verdünnen Sie dann die DOX-Brühe in 1x HBSS. Mischen Sie die Verdünnung mit einem Wirbel und drehen Sie die Verdünnung dann pulsierend, um sie im Röhrchen zu halten. Bereiten Sie für die Injektion eine Injektionsplattform vor. Legen Sie einen Schwamm in eine saubere 100-Millimeter-Petrischale. Schneiden Sie mit Hilfe eines Präpariermikroskops einen Hohlraum in den Schwamm, um einen Fisch aufzunehmen, vier Zentimeter reichen in der Regel aus.

Befestigen Sie anschließend eine 10-Mikroliter-Mikrospritze an einer 34-Gauge-Nadel. Spülen Sie dann die Nadel mit 1x HBSS aus, um Blasen oder Verstopfungen von der Spritze und dem Schlauch zu entfernen. Betäuben Sie nun den erwachsenen Fisch kurz mit Tricain. Tränken Sie dann den Schwamm im Embryowasser mit Tricain und setzen Sie einen Fisch mit dem Bauch nach oben auf den Schwamm für die Injektion. Injizieren Sie nun intraperitoneal DOX-Lösung, indem Sie die Nadel schnell in einem 45-Grad-Winkel etwa 1 bis 2 Millimeter tief in die Mittellinie zwischen den Beckenflossen einführen.

Geben Sie dann langsam die gesamte DOX-Lösung frei. Warten Sie vor dem Zurückziehen der Nadel fünf Sekunden. Alternativ kann der Fisch seitlich mit dem Innenraum nach rechts positioniert werden. Dann injizierten Sie die Seitenlinie über der Beckenflosse, wobei die Abschrägung nach oben in einem 45-Grad-Winkel und 3 bis 4 Millimeter Tiefe in Richtung 7 Uhr zeigte. Wenn eine der beiden Injektionsmethoden erfolgreich war, kommt es zu einer roten Färbung im Bauch.

Bringen Sie den Fisch nach der Injektion schnell in ein sauberes, mit frischem Systemwasser gefülltes Kreuzungsbecken, wo er sich erholen kann. Spülen Sie dann die Nadel mit HBSS aus und injizieren Sie den nächsten Fisch. Später wird der injizierte Fisch wieder in ein System mit laufendem Kreislauf zurückgeführt, das jedoch vom Hauptsystem getrennt ist, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. In den nächsten 24 Stunden den Fisch weiter fasten. Achten Sie in der ersten Woche nach der Injektion darauf, den Fisch täglich zu kontrollieren und alle toten Fische zu entfernen.