Kompetitiver Bindungsassay zur Identifizierung von Verbindungen, die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen stören

Der kompetitive Bindungsassay identifiziert kleine Moleküle, die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen stören, indem sie kompetitiv an einen Zielrezeptor binden und so die natürliche Ligandenbindung hemmen.

Um die Wechselwirkungen eines Rezeptors mit seinem natürlichen Liganden in Gegenwart eines rezeptorspezifischen niedermolekularen Antagonisten zu identifizieren, beginnen Sie mit einer Suspension menschlicher T-Lymphozytenzellen, die den Zielrezeptor exprimieren.

Geben Sie die Zellsuspension in die Vertiefungen einer Multi-Well-Platte, die steigende Antagonistenkonzentrationen enthält. Ausbrüten. Der Antagonist bindet an die orthosterische Bindungsstelle – die natürliche Ligandenbindungsstelle des Rezeptors.

Geben Sie eine feste Konzentration fluoreszenzmarkierter natürlicher Liganden in die Vertiefungen. Ausbrüten.

Bei niedrigen Konzentrationen besetzen die Antagonisten nur wenige orthosterische Bindungsstellen, was eine natürliche Ligandenbindung an die Rezeptoren ermöglicht. Bei höheren Konzentrationen besetzen die Antagonisten jedoch die meisten orthosterischen Bindungsstellen, was eine minimale natürliche Liganden-Rezeptor-Bindung ermöglicht.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in Paraformaldehyd, um sie zu fixieren und die zelluläre Morphologie zu erhalten.

Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Fluoreszenzsignale von einzelnen T-Lymphozyten, die die antagonistischen und fluoreszierenden ligandengebundenen Rezeptoren exprimieren.

Eine dosisabhängige Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität mit zunehmender rezeptorspezifischer Antagonistenkonzentration deutet auf eine kompetitive Bindung der Antagonisten an die orthosterischen Rezeptor-Bindungsstellen hin, wodurch die natürliche Ligand-Rezeptor-Interaktion gehemmt wird.

Sie zunächst 100 Mikroliter der Verbindungslösung in eine durchsichtige 96-Well-Platte mit rundem Boden gemäß einem vordefinierten Versuchslayout.

Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension aus einem Reagenzreservoir mit einer Mehrkanalpipette in die 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter fluoreszenzmarkiertes CXCL12 mit 100 Nanogramm pro Milliliter aus einem ähnlichen Reagenzreservoir in die Vertiefungen der 96-Well-Platte gegeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Zentrifugieren Sie anschließend die 96-Well-Platte bei 400-facher Schwerkraft für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen, indem Sie die Platte umdrehen. Trocknen Sie die Platte auf einem Taschentuch. Geben Sie 200 Mikroliter frischen Assay-Puffer aus einem Reagenzreservoir mit einer Mehrkanalpipette in die Wells.

Fahren Sie sofort fort, die Platte erneut 5 Minuten lang bei 400-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zu zentrifugieren. Entfernen Sie auch hier den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen und dann auf einem Taschentuch trocknen. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern 1% Paraformaldehyd, gelöst in PBS. In diesem Schritt werden die Zellen fixiert.

Um die Proben mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, starten Sie das Gerät und öffnen Sie die entsprechende Software. Wählen Sie die zellularen Parameter aus, die in einem Dot-Blot-Format visualisiert werden sollen, z. B. als Vorwärtsstreubereich, als Seitenstreubereich und in einer Histogrammansicht als Fluorophor-Detektionskanal.

Wählen Sie eine Stichprobe, z. B. eine Negativkontrollprobe, um ein Gating einer definierten homogenen Zellpopulation auf der Grundlage der Parameter Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung durchzuführen. Passen Sie die Einstellungen für das Laden der Zellen in das Durchflusszytometriegerät an.

Wählen Sie vor der Injektion drei Mischungen aus. Wählen Sie die automatische Injektion von 100 Mikrolitern fixierter Zellen und verwenden Sie eine Probenflussrate von 1,5 Mikrolitern pro Sekunde. Führen Sie das Beispiel aus, indem Sie "Daten abrufen" auswählen. Die Parameter für die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung für diese Probe sowie die Fluorophor-Detektion werden nun auf dem Bildschirm angezeigt.

Wählen Sie nun das Gating-Tool der Software aus. Basierend auf der Visualisierung des Forward-Scatter- und Side-Scatter-Dot-Blot-Diagramms können Sie eine homogene und lebensfähige Zellpopulation durch Gating vordefinieren. Wählen Sie diese Option, um 20.000 "Ereignisse" pro Probe zu analysieren.

Das bedeutet, dass für jede Probe 20.000 Zellen analysiert werden, die in ein vordefiniertes Gate fallen. Die Datenerfassung wird fortgesetzt, bis diese Anzahl von Ereignissen erreicht ist.

Starten Sie den Lauf, indem Sie zuerst die zu analysierenden Vertiefungen auswählen. Wählen Sie dann "Run Wells".

Das Durchflusszytometrie-Gerät analysiert nun diese Proben nacheinander, indem es die mittlere Fluoreszenzintensität für jede Probe aufzeichnet, die dem mittleren Fluoreszenzsignal der 20.000 Zellen entspricht, die innerhalb des vordefinierten Gates liegen.

Führen Sie abschließend die Datenanalyse durch, wie im Protokoll beschrieben.