En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

Hola, mi nombre es William Ti.Soy del Arnold Creek Stein Lab. Hoy, yo y otros vamos a mostrarles la inyección intrauterina de embriones de rata E 16. Hola, mi nombre es Laura Elías.

Hoy les voy a mostrar cómo preparar las pipetas de microinyección y cargar las pipetas para las inyecciones intraventriculares y la electroporación que haremos hoy. También les mostraré cómo realizar las inyecciones interventriculares y la electroporación en embriones de rata E 16. Por lo tanto, en el útero, las inyecciones de eyección y la electroporación en la rata son particularmente útiles porque el rojo es un sistema en el que no se pueden hacer fácilmente manipulaciones genéticas.

Bien, hay una serie de herramientas quirúrgicas que usamos para este procedimiento. Usamos un libre, un par de pinzas adicionales, un par que está dentado y otro par que tiene un pequeño diente en el extremo. Usamos un par de hemostáticos.

Este es un par de tijeras, y luego usamos estas dos grapadoras. Estos son los más grandes que usamos para las ratas. Este es el más pequeño que usamos para ratones, usa una grapa de tamaño siete, y esta se usa como una grapa de tamaño nueve y solo están cargados por resorte.

Algunas de las cosas que usamos aquí para ayudar con las cirugías, simplemente usamos una fuente de luz de fibra óptica simple con una cabeza doble. Usamos una almohadilla térmica que justo cuando circula, agua tibia y calentada a través de allí para mantenerla caliente. La superficie de trabajo, utilizamos este sistema de electroporación electiva fabricado por BTX.

Tenemos un par de tamaños diferentes de paletas que usamos en función de qué tan grandes son los embriones. El lado azul es el lado positivo. Muy bien, ahora vamos a biselar nuestras pipetas de inyección.

Y esto es muy importante para que tu pipeta tenga una abertura lo suficientemente grande como para que puedas cargar tu ADN, pero también que esté muy, muy afilada para que no dañe el embrión cuando inyectes. Y si dañas el embrión cuando te inyectas, vas a tener una tasa de mortalidad mucho más alta. Y eso no es bueno.

Así que este es en realidad un proceso muy importante como en esta cirugía. Y primero vamos a poner un poco de agua en esta piedra biselada que está girando aquí. Y luego vamos a tomar, veamos aquí, solo un, un, un palo.

Y vamos a colocar nuestra pipeta que acabamos de tirar en este palo con un poco de cinta adhesiva. Y vamos a usar uno de estos micro manipuladores para sujetar la pipeta en el bisel y permitir que se bisele aquí. Así que simplemente colocaremos esto y usaremos un microscopio para visualizar la punta de la pipeta.

Y lo colocaremos justo en el agua encima del bisel antes para que haya un poco de presión. Y Uds. pueden ver la punta presionando contra la, la, la piedra aquí. Y deja que se bisele durante algún tiempo durante al menos, ya sabes, 15 minutos.

Me gusta dejarlos incluso durante, ya sabes, una hora. A veces son simplemente, se vuelven muy, muy afilados, pero definitivamente depende de cada persona cuánto tiempo biselan sus pipetas. Muy bien, aquí tenemos, pueden ver en la parte superior que tenemos una pipeta que se ha tirado y que aún no se ha biselado.

Entonces, aunque es afilado, no tiene ninguna abertura a través de la cual pueda cargar su ADN. Ahora la pipeta inferior ha sido biselada, y puedes ver esta bonita abertura en ángulo que te permitirá cargar tu ADN, pero todavía tiene una punta afilada para que puedas inyectar sin crear ningún daño. Muy bien, ahora vamos a llenar nuestras pipetas de inyección con ADN.

Por lo tanto, es importante que prepare su ADN libre de endotoxinas para que no se inyecte ninguno de los lipopolisacáridos cuando inyecte su ADN. Así que vamos a tomar nuestro ADN y aquí, preparar nuestra paraforma. Así que vas a hacer tu paraforma aquí y vas a querer recolectar tu ADN y simplemente colocarlo como un pequeño punto en este parámetro.

Y luego vamos a tomar, por lo que generalmente tomo por cada 10 microlitros de mi ADN, que generalmente uso alrededor de 1.5 a 1.7 microgramos por microlitro. Usaré aproximadamente un microlitro de este tinte en crema rápido. Y esto es solo para ayudarnos a localizar nuestra inyección y asegurarnos de que hemos inyectado con éxito en el ventrículo.

Así que luego mezclaré este tinte verde rápido con mi ADN. Y luego toma su electrodo de inyección y simplemente estaremos llenando la pipeta tirando hacia atrás del émbolo. Y se puede ver aquí si la pipeta es correcta y tiene una abertura bastante grande, el DNI debería cargarse con bastante facilidad.

A veces es necesario mover el émbolo hacia adelante y hacia atrás para ayudar a que se cargue correctamente. Y así puedes cargar la pipeta así. Y así tenemos el ADN completamente cargado en esta pipeta y está lista para la inyección.

Bien, entonces voy a anestesiar al animal. Nosotros usamos estos conos dec capi. Simplemente enrollo el borde hacia atrás para que sea más fácil de sostener.

Así que comencemos. Por lo general, lo pongo en el borde de la jaula para hacer un pequeño túnel agradable para que entre así. Está bien, este animal parece que está caído.

Vamos a seguir adelante y hacer un pellizco en el dedo del pie para confirmar eso y solo necesitamos agarrar el dedo del pie, darle un buen pellizco. No demasiado difícil. No querrás lastimar al animal, solo asegurarte de que esté caído.

Y este animal está definitivamente caído. Así que voy a seguir adelante y afeitarle la barriga. Solo quiero evitar el tet para que no les cortes los extremos.

Creo que podría ser muy doloroso para el animal. Así que el animal se afeita. Ahora voy a llevarlo al capó.

Vamos a lavarla y comenzar el procedimiento. Bien, hemos confirmado que este animal está fuera una vez más y estamos listos para lavarla primero. Lo que quiero hacer es ponerle un poco de ungüento para los ojos, y eso es solo para evitar que sus ojos se sequen cada ojo.

Y luego lo que vamos a hacer es alternar el lavado con almohadillas de preparación con alcohol y almohadillas de yodo. Lo hacemos tres veces, tres toallitas alternas. Tenemos que ser muy suaves para que no dañes los embriones mientras haces esto.

Así que solo quieres deslizar el dedo hacia abajo, solo esperar hacia atrás. Este es el número uno. Solo tengo que mojarla bien y mojarla primero para poder hacer las toallitas. Bien.

Son dos y son tres. Bien, le hemos puesto esta funda para ayudar con la esterilidad y ahora voy a seguir adelante y abrir el animal. Así que vamos a cortar.

Muy bien, lo primero que tengo que hacer es ponerme el ster. Nos ponemos guantes estériles y estamos listos para abrir aquí. Siempre hay que confirmar que el animal sigue caído.

Así que haré otro pellizco en el dedo del pie y lo haremos durante todo el procedimiento. Por lo general, lo que hago es seguir adelante y pellizcar un poco del pañuelo. Hago una incisión rápida, la agarro por la parte superior y la corto hacia abajo, agarro el otro par de pinzas, separo el tejido.

Luego agarras el músculo que quieras, corta justo en la línea media para que no escuches ningún vaso o nervio. Ten cuidado de no agarrar a Sure. Así que parece que tenemos un buen rendimiento aquí.

Quiero asegurarme y mantenerlo bien lubricado para que no se seque. Y haré otra ficha solo para asegurarme de que estamos bien y parece que estamos bien. Así que siempre coloco estos para Laura, y lo que suelo hacer es tener, o lo que siempre hago es tener la cabeza en la posición de modo que la cabeza del embrión esté en los pasillos del lado derecho de la rata madre solo para uniformidad.

Y por eso empezaré ahora. Así que aquí podemos ver el embrión. Podemos ver la cola y la lente trasera aquí, y la cabeza más arriba aquí.

Así que aquí estamos viendo la cabeza de este embrión. Puedes ver la línea media aquí en esta línea oscura. Puedes ver el hemisferio izquierdo y el hemisferio derecho, así como hay un cerebro posterior.

Ahora voy a apuntar al hemisferio izquierdo en la inyección. Inyecte la pipeta, tire un poco hacia arriba e inyecte el tinte. Así que ahora se ve que se está extendiendo hacia el ventrículo lateral izquierdo.

Y eso parece ser una inyección exitosa. Muy bien, ahora vemos que el ventrículo se ha llenado bien. En realidad, el tinte se pasa del ventrículo izquierdo al derecho.

Así que tenemos D y ADN en ambos ventrículos. En este punto, voy a tomar mis electrodos de electroporación y colocarlos a través del cerebro con un electrodo positivo en el lado izquierdo. Así que aquí, para que el ADN entre en los progenitores y en la pared cortical del hemisferio izquierdo.

Y ahora estoy pasando la corriente. Y cuando comenzamos a pasar la corriente eléctrica, se ve algo de espuma en el extremo negativo del electrodo. Y esto es tranquilizador y te dice que has hecho los contactos correctos.

Bien, ahora que hemos electro estos embriones, voy a seguir adelante y volver a ponerlos y coserlos. Ahora le voy a dar 10 milésimas de pulgada de sutura quirúrgica antibiótica. Me gusta usar puntos cuadrados.

Después de eso, vamos a grapar la piel con la grapadora de piel. ¿Bien? Okay.So le he dado una dosis de buprenorfina para asegurarme de que no experimente ningún dolor cuando salga. Y ahora la pondré en la incubadora y eso la mantendrá caliente mientras sale, solo para asegurarme de que no experimente ninguna hipotermia.

Bien, acabamos de mostrarle cómo realizar inyecciones en el útero, intraventriculares y electroporación. En la rata, se pueden inyectar varias cosas diferentes. Simplemente puede inyectar un virus, incluido el lentivirus o el retrovirus, directamente en el ventrículo.

Y en este caso, no será necesario hacer la electroporación porque el virus se integrará en las células. Si inyectas plásmidos, plásmidos de ADN, como hicimos hoy, tendrás que realizar la electroporación para que los plásmidos entren en las células que recubren el ventrículo. Así que puedes usar estos vectores para una serie de posibilidades.

Puedes usarlos simplemente para seguir a las células y expresar GFP, y luego puedes ver cómo estos progenitores se dividen y migran. También puede utilizar estos vectores para manipular las celdas. Por lo tanto, puede expresar horquillas S-H-R-N-A y, por lo tanto, puede derribar genes específicos.

También se pueden sobreexpresar genes específicos y, de esta manera, se pueden manipular las células que se han electroporado o infectado con el virus. Y esta puede ser una técnica muy poderosa para estudiar el papel de proteínas específicas en el proceso que te interesa. Y esto es específicamente muy importante para los estudios en ratas porque no se pueden hacer manipulaciones genéticas en ratas tan fácilmente como en ratones.