단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 세포 내 사건을 연구하기 위해 단일 초파리 또는 마티아를 해부하고 이미지화하는 것입니다. 신경 퇴행 모델에서. 이것은 먼저 몸체의 나머지 부분에서 플라이 헤드를 부착하고 절단하여 열어 수행됩니다.

다음으로 뇌와 다른 조직들이 머리 안쪽에서 제거된다. 그런 다음 큐티클을 제거하고 각 망막을 반으로 자릅니다. 절차의 마지막 단계는 텅스텐 바늘로 O를 조각하여 슬라이드에 놓는 것입니다.

궁극적으로 형광 공초점 현미경을 통해 세포질 자가포식 소기관을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 퇴행에 대한 초파리 모델에서 고해상도 세포 생물학적 분석을 가능하게 한다는 것인데, 지금까지는 이 분야에서만 유전적 통찰력을 제공할 수 있었으며 절차가 가변적일 것임을 보여줍니다. 제 연구실의 한 대학원생이 센터의 조직학 및 현미경 검사 기술자인 다니엘 맥케이(Daniel Mackay)의 도움을 받았습니다.

먼저 3웰 유리 슬라이드의 한 웰에 인산염 완충 식염수를 채우고 파리를 이산화탄소로 마취합니다. 파리가 마취되면 집게를 사용하여 파리 한 마리를 집어 PBS의 작은 접시에 떨어뜨립니다. 해부 내시경으로 집게로 주둥이를 꼬집은 다음 목을 절단하여 몸통에서 머리를 분리합니다.

주둥이에서 파리 머리를 잡고 있는 두 번째 집게 세트를 사용하여 마이크로 가위로 외측 주부 정중선을 따라 머리를 반으로 자릅니다. 뇌를 드러내려면 절단된 피펫 팁을 사용하여 머리를 집어 들고 망막을 부착한 다음 슈나이더 배지로 채워진 다른 우물로 옮깁니다. 집게로 머리 큐티클의 대부분을 벗겨낸 다음 뇌를 제거합니다.

망막을 얇은 판과 각막 사이에 끼워 두십시오. 다음으로, 망막을 50마이크로리터의 새 슈나이더 배지 방울로 옮깁니다. 유리 슬라이드에 직접 놓고 마이크로 가위를 사용하여 집게로 망막의 가장 등쪽 또는 복부 끝을 잡습니다.

등쪽 복부 정중선을 따라 망막을 반으로 잘라 눈 중앙의 AMIA를 노출시킵니다. 각막이 아래를 향하고 얇은 판이 위를 향하도록 망막을 계속 잡습니다. 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 먼저 얇은 판에서 이오이를 분리한 다음 각막에서 분리하십시오.

단일 oia 및 OIA 그룹은 우물 또는 슬라이드의 바닥에 모입니다. 진행하기 전에 모였을 수 있는 더 큰 낮 호흡을 제거하십시오. 자가포식을 분석하기 위해 Schneider 배지 혼합물 한 방울에 Lito 추적기를 1에서 1000까지 희석하고 10초 동안 기다립니다.

슬라이드에서 여분의 액체를 제거합니다. AMIA를 버리지 않도록 주의합니다. 아미아를 덮기 위해 벡터 쉴드 한 방울을 추가합니다.

컨포칼 현미경을 사용하여 매니큐어로 커버를 적용하고 슬립 및 밀봉하면 g fp a TG 8로 표시된 두 phagosome과 lyo Tracker로 표시된 lysosomes를 아트로핀의 돌연변이 형태를 발현하는 파리에서 해부한 단일 테디움으로 시각화할 수 있습니다. 오른쪽 상단의 명시야 패널은 지루함의 거의 손상되지 않은 구조를 표시하고 프레임은 스캔된 영역을 나타냅니다. 여기서 빨간색은 리소좀을 표시하고 녹색은 자가포식솜을 표시합니다.

두 소기관의 융합으로 인한 자동 리소좀(auto lysosome)은 노란색으로 나타납니다. 이 절차에 따라 재료 배양 및 약물 투여와 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 질문에 답할 수 있습니다. 서로 다른 유전적 배경을 가진 신경 세포의 자가포식 플래그에 있는 효과적인 화합물과 같습니다.

초파리 유전학의 장점과 세포 배양에서 가능한 일부 고급 세포 생물학적 분석을 결합합니다.