La tinción histoquímica de Arabidopsis thaliana Celda Secundaria Elements Pared

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la tinción histoquímica de los elementos de la pared celular secundaria del ANA de Arabidopsis. Esto se logra incrustando primero el tallo de la planta en aros. A continuación, el vástago incrustado de aros se funde y se transfiere a discos de muestra, que luego se seccionan en secciones transversales de vástago mediante un vibrato.

A continuación, las secciones se someten a diversos procedimientos de tinción histoquímica. En última instancia, la microscopía se utiliza para mostrar los cambios diferenciales en los elementos de la pared celular secundaria obtenidos por la tinción histoquímica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la pared celular, como los cambios en los tejidos maculares en los tallos de las plantas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los pasos simples pero críticos mencionados en los protocolos aquí no se han documentado a fondo o se han presentado de manera simplista antes. Para empezar, prepara un molde casero para incrustar los tallos con frascos de plástico. Primero, use una hoja de afeitar para cortar la parte inferior cónica de un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de dos mililitros.

Este componente se denomina parte A con una punción de aguja de jeringa, un orificio en la tapa del tubo ligeramente más grande que el diámetro del vástago que se va a incrustar. A continuación, corte medio centímetro de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,6 mililitros. Este componente se denominará Parte B.Agregue la porción de medio centímetro recortada del tubo de microcentrífuga de 0,6 mililitros en el tubo de microcentrífuga precortado de dos mililitros.

Selle las dos partes con paraform. Con una cuchilla de afeitar, corte una sección del tallo del área de interés, derrita una solución de 7%aros en el microondas a baja intensidad. Una vez que el aros derretido se enfríe a unos 50 grados centígrados, pipetee lentamente cinco mililitros de agros en el molde de plástico prefabricado para llenar el vial.

Después de que el aros se haya enfriado durante 30 a 60 segundos y sea semisólido, coloque el tallo en el vial lleno de aeros. A continuación, coloque la tapa perforada de tal manera que la punta del tallo quede sujeta por la tapa. Deje el vial a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante 10 a 30 minutos hasta que se solidifique.

Retire el molde deslizándolo suavemente fuera del tubo. Abra la película para y empuje suavemente la parte inferior de la parte B del lunar con el pulgar para liberar los aros solidificados de la parte A en un microscopio de vidrio. Corte de diapositivas.

El tallo incrustado en tres piezas aproximadamente iguales de 1,2 centímetros de longitud. Corta la parte del tallo que no estaba en el aros y deséchalo. Asegúrese de que el disco de muestra esté limpio y completamente seco.

Use toallitas de papel suave para eliminar la humedad del bloque de aros que contiene las muestras. Coloque una pequeña gota de adhesivo para tejidos en el disco de muestra. Coloque rápidamente el bloque aros de modo que las muestras queden perpendiculares a la placa para secciones transversales o en paralelo con la placa.

Para secciones transversales longitudinales, deje que el adhesivo fije la muestra al disco de muestra a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante 10 a 30 minutos. Fije el disco de muestra en su lugar en la bandeja de almacenamiento intermedio o a través del bloque de aros con las secciones deben estar en paralelo con la hoja de afeitar. Llene la bandeja tampón con agua destilada a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente sumergidas.

Corta una hoja de afeitar por la mitad y luego recorta los extremos con unas tijeras resistentes para que la hoja quede completamente plana. Coloque la mitad de la hoja de afeitar precortada en el soporte del cuchillo. Ajuste el ángulo del portacuchillos a 84 grados, la velocidad a 0,90 milímetros por segundo y la frecuencia a 50 hercios.

Corte las secciones a 100 micras de grosor usando el modo continuo. Recoja las secciones con una pipeta de plástico desechable durante el corte en la bandeja tampón. Transfiera algunas secciones a los dos tubos de microcentrífuga de mililitros para la tinción con fluorol.

Transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de la solución de fluorol al tubo y táptelo inmediatamente. Debido a que el ácido clorhídrico en la tinción de anol fluorescente es altamente corrosivo, mueva suavemente el tubo para asegurarse de que todas las secciones estén manchadas.

Coloque suavemente las secciones en una punta de pipeta cortada y en un microscopio. Diapositiva. Cubra las secciones con un cubreobjetos. Observe las secciones bajo iluminación de campo claro.

La solución se seca en cinco a 10 minutos, causando un deterioro de las muestras. Por lo tanto, las imágenes deben completarse dentro de ese período de tiempo. Para la tinción incorrecta, transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga.

Agregue un mililitro de la solución de permanganato de potasio al 0,5% al tubo que contiene las secciones. Pipetear suavemente la solución de permanganato de potasio al 0,5%, preferiblemente sin alterar las secciones. Después de una incubación de dos minutos y un pipeteo repetido, deje reposar el tubo de microcentrífuga hasta que todas las secciones se asienten.

Con una pipeta de un mililitro, extraiga 700 microlitros de solución de permanganato de potasio al 0,5%, agregue 700 microlitros de agua destilada para enjuagar el permanganato de potasio. Repita tres o cuatro veces o hasta que la solución de agua permanezca clara. Después de desechar el agua, agregue rápidamente un mililitro de ácido clorhídrico al 3% hasta que el color marrón oscuro se elimine de las secciones.

Esto puede suceder dentro de tres a cinco minutos o puede requerir dos lavados de cinco minutos. Cada pipetea toda la solución de ácido clorhídrico al 3% e inmediatamente agrega un mililitro de solución concentrada de hidróxido de amonio. Antes de obtener imágenes bajo iluminación de campo claro para la tinción de rojo Congo, transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga y agregue un mililitro de la solución de rojo Congo al 0,5%.

Pipetear suavemente la solución de rojo Congo al 0,5% hacia arriba y hacia abajo sin alterar las secciones. Antes de incubar y lavar las secciones como se describe en el protocolo de texto, pipetee suavemente las disecciones en una punta de pipeta cortada y en un portaobjetos de microscopio. A continuación, cúbralos con un cubreobjetos.

Observe las muestras en el microscopio. Deslícese bajo la excitación de luz azul usando un filtro de emisión de 560 nanómetros para la tinción blanca de calcior. Transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga y agregue un mililitro de la solución blanca de calcior al 0,02%.

Pipetea suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo. Proceda a incubar y lavar las secciones como se detalla en el protocolo de texto antes de observar las secciones bajo luz ultravioleta. Para la tinción con azul de toluidina O, transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga.

A continuación, añada un mililitro de la solución de azul de toluidina O al 0,02% al tubo y pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo. A continuación, incube y lave las secciones como se describe en el protocolo de texto antes de observarlas bajo una iluminación de campo claro. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre la configuración del microscopio y la cámara para la obtención de imágenes, así como para el procedimiento de imágenes ultravioleta y de campo claro.

Los compuestos aromáticos, incluida la lignina en las células, se pueden visualizar por su autofluorescencia bajo luz ultravioleta. El xilema y las fibras interf mostraron autofluorescencia bajo iluminación UV, pero no en la médula y la corteza o la epidermis porque la lignina y el polímero aromático se depositan durante la célula secundaria, mientras que la tinción de fluorol de biosíntesis reacciona con los grupos extremos de aldehído de la lignina para dar un color rosa o fucsia como se observa bajo iluminación UV. Se observa una coloración fucsia en el xilema y las fibras interf, pero está ausente en la médula y la corteza o epidermis.

Por lo general, la intensidad del color se correlaciona con el nivel de lignificación de manera cualitativa. La tinción MALS es específica en la detección de las unidades ingales de lignina en el xilema y las fibras interf. La coloración roja indica la presencia de unidades ingales de lignina en los elementos de lignina.

Sin embargo, se observa una coloración roja más brillante en las fibras en comparación con los tejidos del xilema, lo que sugiere que las fibras contienen un mayor nivel de lignina ingal, mientras que el xilema está más enriquecido en unidades de lignina gua. Las secciones del tallo teñidas con blanco calcior se observaron bajo luz ultravioleta y revelaron que la corteza y la médula de la epidermis estaban teñidas porque todos estos tejidos contenían celulosa como un polímero polisacárido principal en sus paredes celulares. Se observaron secciones teñidas de rojo Congo bajo excitación con luz azul y también teñidas la corteza y la médula de la epidermis.

A diferencia del calcior blanco, el rojo Congo teñió mejor los polisacáridos en el xilema y las fibras interf, y pareció menos afectado por la presencia de lignina odina. El Blue O se clasifica como un tinte policromático porque da como resultado un espécimen multicolor. El azul Odine O es un tinte ónico que se une a los grupos cargados negativamente y genera diferentes colores.

Cuando el colorante se une con diferentes grupos ónicos en la célula, el azul Taine O de las secciones transversales del tallo reveló que el xilema y las fibras interfasciculares están lignificadas ya que muestran una coloración azul verdosa o azul, que está de acuerdo con los rayos UV y el fluoroglucano. Por el contrario, la médula y la corteza y los tejidos de la epidermis muestran una coloración azul verdosa o azul porque, aunque no están lignificados, contienen algunos polímeros de pectina en sus paredes celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seccionar los tallos de las plantas y teñir diferencialmente los diversos tejidos de la pared celular de la planta con diferentes tinciones histoquímicas.